色谱条件对果汁饮料中糖精钠含量测定的影响

王彬，何冲，刑辽

陕西省产品质量监督检验研究院（西安 710048）

食品添加剂因具有防止食品腐败变质、改善食品感官品质、提高食品营养价值[1]、增加食品种类[2-3]等功能，被誉为现代食品工业的灵魂。近年来，食品添加剂产业迅速壮大[4]。糖精钠，学名邻苯甲酰磺酰亚胺钠，为白色结晶性粉末，易溶于水，是常用的有机化工合成甜味剂，其甜度为蔗糖的300～500倍，可部分代替蔗糖用于饮料、蜜饯凉果、焙烤食品等。糖精钠不被人体分解吸收，作为食品添加剂仅具备提供甜味的功能，少剂量摄入短时会随尿液排出体外，但短时间内大量摄入糖精钠会造成急性大出血、多脏器损害等中毒现象[5-6]。因此，精准检测食品中糖精钠含量的技术优化尤为关键。

糖精钠含量检测最常采用GB 5009.28—2016《食品安全国家标准食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定》[7]中的液相色谱法，但受样品成分、样品性状的干扰，按照现有色谱条件并不能准确测量果汁饮料中的糖精钠含量。随检测技术的迅速提高，液相色谱串联质谱法、气相色谱串联质谱法、离子色谱串质谱法等技术的运用可大幅提升糖精钠检测的准确性。但由于大多数检测设备欠缺及成本限制，新型技术无法普及，液相色谱法仍是测定糖精钠含量的常规首选方法。研究表明色谱柱是液相色谱的核心技术，选择适宜的色谱柱可达到较好的分离效果，极大程度提高检测的精密度[8-9]。流动相的正确选择可有效分离待测物与杂质，缩短目标物的保留时间[10]。卢连登等[11]对比等度洗脱和梯度洗脱对黑蒜中蒜氨酸及相关硫化物含量测定的影响，结果发现等度洗脱出峰时间适宜、峰形更好、分离效果更佳。

参考GB 5009.28—2016，通过测定不同色谱柱、流动相、标准曲线范围、洗脱方式对糖精钠定量的影响，优化高效液相色谱法测定果汁饮料中糖精钠含量的色谱条件，以便于更精准进行定量测定。该色谱条件的建立对常规果汁饮料中糖精钠定量测定技术精密度的提高具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

果汁饮料（北京汇源饮料食品集团有限公司）；甲醇[色谱级，赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；甲酸（优级纯，上海麦克林生化科技有限公司）；乙酸铵（优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）；糖精钠（1 000 μg/mL，上海安谱实验科技股份有限公司）。

1.2 仪器与设备

LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）；0.22 μm亲水型PES滤头（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Poroshell 120 EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；岛津ODS-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；ACE柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.3 试验方法

1.3.1 糖精钠标准溶液的配制

移取1.0 mL 1 000 μg/mL糖精钠储备液，加水定容至10 mL，配制成100 μg/mL糖精钠标准使用液，冷藏避光保存。

1.3.2 流动相配制

乙酸铵溶液（20 mmol/L）：称取1.54 g乙酸铵，加水定容至1 000 mL，经0.22 μm滤膜过滤。

甲酸乙酸铵溶液（2 mmol/L甲酸+20 mmol/L乙酸铵）：称取1.54 g乙酸铵，吸取75.2 μL甲酸，加水定容至1 000 mL，经0.22 μm滤膜过滤。

1.3.3 样品前处理

称取2 g（精确至0.01 g）样品，加20 mL超纯水超声溶解，移至50 mL离心管，振荡5 min，按4 000 r/min离心10 min取上清液，再次于沉淀中加入20 mL超纯水重复提取，均质离心取上清液。合并2次上清液并定容至50 mL，经0.22 μm滤膜过滤后上机测定。

1.3.4 色谱条件

色谱柱采用ACE柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A为0.02 mol/L乙酸铵溶液，流动相B为甲醇-水（95∶5，V/V）；流速1.0 mL/min；检测波长230 nm；进样量10 μL；柱温35 ℃；采用等梯度洗脱。

1.4 数据处理与分析

运用高效液相色谱仪LabSolutions软件采集数据及绘制谱图，采用JMP Pro 14.0软件对试验数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 不同色谱柱对糖精钠定量测定的影响

试验选取5种常见色谱柱，即Plus C18柱、XDB-C18柱、Poroshell 120 EC-C18柱、岛津ODS-C18柱和ACE柱，参照GB 5009.28—2016的色谱条件进行对比，结果见图1。样品通过5种色谱柱分离，Poroshell 120 EC-C18柱因粒径较小，流速较低，糖精钠出峰最晚，峰形较宽，且出峰位置基线较不平稳。XDB-C18柱，糖精钠出峰位置出现明显干扰峰，分离效果不佳。Plus C18柱、岛津ODS-C18柱和ACE柱，糖精钠峰形均呈对称尖锐状，且出峰时间无明显差异。

图1 5种色谱柱测定糖精钠的色谱图

糖精钠定量测定结果如表1所示。在不同色谱柱下糖精钠含量的测定结果存在较大差异，最大两组差异偏差超过10%。Plus C18柱，糖精钠定量结果偏高，可能是由于样品在428 nm存在吸收，无法将杂质与糖精钠有效分离引起。ACE柱色谱柱分离测定的糖精钠含量与真实值的偏差最小，效果最佳。其次为XDB-C18柱。

表1 5种色谱柱测定的样品中糖精钠含量结果（n=6）

图2 Plus C18柱光谱对比图

2.2 不同流动相对糖精钠定量测定的影响

国标测定糖精钠含量常用甲醇乙酸铵作为流动相，存在干扰峰时加入甲酸可有效分离干扰峰[12]。分别以甲醇乙酸铵溶液、甲醇+甲酸乙酸铵溶液为流动相，在相同的色谱条件下测定糖精钠含量。结果显示以甲醇乙酸铵、甲醇+甲酸乙酸铵作为流动相测得的糖精钠含量与实际含量（14.486 mg/L）的偏离程度差异不大。由图3和图4可知，两种流动相峰形均较好。与标准品的色谱图对比，甲醇+甲酸乙酸铵作为流动相保留时间为10.438 min，加酸使糖精钠的出峰时间提前，可缩短检测时间。甲醇乙酸铵作为流动相，与杂质峰分离效果更好，基线也较为平稳，且SRSD较小，稳定性更好，因此选用甲醇乙酸铵溶液作为流动相进行果汁饮料中糖精钠的定量测定。

表2 不同流动相测定的样品中糖精钠含量结果（n=6）

图3 甲醇乙酸铵溶液作为流动相时标准品与样品对比图谱

图4 甲醇+甲酸乙酸铵溶液作为流动相时标准品与样品对比图谱

2.3 不同标准曲线范围对糖精钠定量测定的影响

分别配制1，5，10，20，50，100，200 μg/mL系列和5，10，15，20，30，50 μg/mL系列的糖精钠标准溶液，以这2种标准曲线对样品进行定量测定，结果见表3。结果表明，XDB-C18柱和ACE柱均在5～50 μg/mL线性范围内糖精钠含量测定结果与真实值偏差较小，为保障测定结果更加准确，应适当缩小线性范围，且严格控制待测样品浓度在线性范围内。

表3 不同标准曲线范围测定的样品中糖精钠含量结果（n=6）

2.4 梯度洗脱和等度洗脱对糖精钠定量测定的影响

采取GB 2760—2014检测条件，选用ACE色谱柱对比等度洗脱和梯度洗脱，测定的糖精钠含量结果见表5。实际工作中测定样品种类复杂，大批量进样时杂质洗脱效果不佳，保留在色谱柱内极大降低分离效率，且容易造成堵塞。而梯度洗脱可有效洗脱杂质，延长色谱柱寿命，改善待测物峰形，减少长时进样保留时间漂移等问题[13]。对比2种洗脱程序色谱图发现，待测物均能较好地与杂质峰分离，且峰形较好，基线均平稳，保留时间差别不大。采用梯度洗脱及等度洗脱糖精钠定量的结果偏差均小于0.5%，但梯度洗脱结果准确性略高，且SRSD值较小，稳定性更好。

表5 不同洗脱程序样品中糖精钠含量结果（n=6）

图5 等度洗脱程序下测得的样品色谱图

图6 梯度洗脱程序下测得的样品色谱图

表4 梯度洗脱程序

2.5 质控样品中糖精钠含量测定结果对比

质控样品测定是衡量检测准确性的重要标准，有助于进行纠偏分析，提升实验室的检测能力[14]。采用试验确定的最佳色谱条件，选用XDB-C18柱、ACE柱对质控样品中糖精钠含量进行测定，结果见表6。ACE柱测得的结果更接近真实值，且偏差更小。但2种色谱柱测定的糖精钠含量结果差异不大明显，偏差约0.5%，证实所筛选的色谱条件具有稳定可靠性。

表6 质控样品中糖精钠含量测定结果（n=6）

2.6 果汁饮料中糖精钠加标回收情况

选择一款食品标签上不含糖精钠的果汁饮料（汇源果汁），按照上述步骤制样，在制得的样液中分别加入7，14和28 mg/L的糖精钠标准溶液，加标回收试验结果见表7。结果表明不同加标量水平的回收率均在95%～100%之间，SRSD均小于0.5%，表明该方法精确度高，准确性好，能够较准确地对果汁饮料中糖精钠进行定量测定。

表7 果汁饮料中糖精钠回收率和精密度试验结果（n=6）

3 结论

在GB 5009.28—2016基础上，通过测定不同色谱条件对糖精钠定量的影响，优化一系列可准确定量果汁饮料中糖精钠含量的色谱条件。选用ACE色谱柱，流动相为甲醇乙酸铵溶液，标准曲线取值范围5～50 μg/mL，采用梯度洗脱时，回收率在95%～100%之间，SRSD值小于0.5%。该色谱条件精确度高，能准确对糖精钠进行定量测定，为日常果汁饮料中糖精钠含量的实际测定提供一定理论支撑与技术保障。