滇金丝猴尖尾食道口线虫的鉴定

陈 越，谢昕言，张誉方，杨建发，贺君君，王 昂，王荣琼

(1.云南省昆明市五华区昆明动物园，云南昆明 650021；2.云南农业大学动物医学院，云南昆明 650201；3.云南农业职业技术学院，云南昆明 650212)

滇金丝猴(Rhinopithecusbieti)是我国特有的一级珍稀濒危保护动物，也是世界自然保护联盟红色名录中的濒危物种。其在系统发育上处于旧大陆猴与猿之间的特殊分类地位，具有极高的科研价值和观赏价值。滇金丝猴消化道易感寄生虫种类较多，常见寄生虫有钩虫、蛔虫、毛首线虫、食道口线虫、肝毛细线虫等[1]，这些寄生虫严重威胁着滇金丝猴的健康。云南地区某动物园于2021年7月救助1头滇金丝猴，次年1月该滇金丝猴出现食欲减退、腹部膨胀的症状，经B超、X光检查确诊该滇金丝猴患有结肠梗阻，对其进行手术后因抢救无效而死亡。对该病猴进行尸体剖检发现其结肠黏膜表面分布有大小相近的纽扣状结节，且结肠段内有大量线状虫体，经形态学观察初步判定为线虫。为进一步确定该滇金丝猴感染的寄生虫种类，将其肠道内的虫体取出进行形态学检测并提取虫体DNA进行分子生物学检测。本研究对滇金丝猴消化道线虫虫体进行形态学和进一步分子生物学检测以及种系发育分析，为滇金丝猴体内线虫的分类、鉴别诊断、分子流行病学调查等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 虫体样品 滇金丝猴消化道线虫为2022年1月从云南省某动物园采集。

1.1.2 主要试剂 琼脂糖粉、dd H2O、1×TAE缓冲液、粪便DNA提取试剂盒，均为天根生物科技有限公司产品；GelStain核酸染料(全式金)，丰科生物科技有限公司产品；2×PCR Master Mix、DNA Marker DL 2 000，均为宝生物工程(大连)技术服务有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 生物显微镜(B302)，重庆奥特光学仪器有限责任公司产品；PCR仪(PTC-1148)，Bibby Scientific公司产品；凝胶成像系统(WGD-30)，大韩科学仪器有限公司产品；高速台式离心机(Model CF-10)，Wise Spin公司产品；电子分析天平(BSA124S型)，德国赛多利斯公司产品；旋涡混合器(QL-901)，江苏海门市麒麟医用仪器厂生产；恒温水浴箱(HH-W600)，深华生物技术有限公司产品；瞬时迷你离心机(Mini-6K)，湘仪离心机仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 形态学 用光学显微镜观察虫体样品的形态结构，并拍下虫体图片，进行初步形态学鉴定。样品保存于装有 700 mL/L 酒精的玻璃瓶中保存备用。食道口线虫的特征为：虫体头部前端有一圆筒形口囊，有膨大头泡与颈沟，颈沟位于腹面，雄虫有发达的交合伞且有一对等长交合刺，雌虫阴门、肛门突出，且肛门后急剧变细[2]。

1.2.2 样品DNA制备 从700 mL/L的酒精保存液中取出单个虫体，用双蒸水反复冲洗3次，置于1.5 mL灭菌离心管中；用灭菌的微型剪刀将虫体组织剪碎，反复研磨，根据试剂盒说明书加入200 μL缓冲液GA与20 μL蛋白酶K，混匀后将样品置于56℃的水浴锅里消化15 h～18 h；将消化好的混悬液根据DNA提取试剂盒说明书提取虫体DNA，DNA样品置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.3 PCR扩增cox1基因 参照文献[3]的报道设计引物，扩增此线虫的cox1基因，预期扩增的目的片段大小约为420 bp，上游引物JB3：5′-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3′，下游引物JB4.5：5′-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3′，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应扩增体系在25 μL下进行：上、下游引物各0.5 μL，模板 DNA 1 μL，双蒸水10.5 μL，2×PCR Master Mix 12.5 μL。PCR扩增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共36个循环；最后72℃延伸5 min，16℃结束反应。同时设阴性对照。取5 μL PCR产物进行10 g/L TAE琼脂糖凝胶电泳，用GelStain核酸染料染色，紫外投射仪下观察结果，凝胶成像系统摄像。

1.2.4cox1基因部分序列测定及系统进化树构建 将阳性PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行双向测序，测序结果进行拼接，并于NCBI进行Blast在线比对分析。用MEGA6.0软件构建进化树，以捻转血矛线虫(Haemonchuscontortus)作为外群，方法为相邻法，Bootstrap置信值重复抽样1 000次。

2 结果

2.1 形态学诊断

光学显微镜下观察到虫体前端有膨大的头泡(图1A)，雌虫虫体自肛门之后急剧变细(图1B)，雄虫交合伞发达(图1C)，结合文献和寄生虫图谱[4]，初步鉴定为食道口线虫(Oesophagostomum)。

A.头泡(100×); B.雌虫尾部(100×); C.雄虫尾部(100×)

2.2 PCR扩增

样品成功扩增出长度为442 bp 的基因片段，与预期cox1基因目的片段长度相符，且无非特异性条带，空白对照为阴性(图2)。

M.DNA标准DL 2 000；1.样品；-.阴性对照

2.3 cox1基因部分序列测定及系统进化树构建

测序结果显示，扩增获得的线虫cox1基因序列片段长度为442 bp；比对结果显示，样品与尖尾食道口线虫(Oesophagostomumaculeatum)相似度高达99.74%。用MEGA6.0软件相邻法构建种系发育进化树(图3)。结果表明，本研究的样本与Genbank中检索到的登录号为LC428819.1的尖尾食道口线虫的序列汇在同一小分支，表明样品与来自马来西亚的婆罗洲猩猩体内分离的虫株亲缘关系最近；其次与来自日本的猕猴体内分离出的尖尾食道口线虫分离株与本样品聚在同一大分支，表明其间具有较近的亲缘关系。

3 讨论

尖尾食道口线虫在金丝猴的寄生虫感染中较为常见。食道口线虫病感染由于对宿主的免疫反应较弱，生前一般很难做出诊断[5]，通常患病猴会出现食欲减退或食欲废绝，饮水量增加，稀便甚至会出现血便。尖尾食道口线虫在幼虫时期由小肠黏膜移行至大肠黏膜上，其幼虫在肠黏膜移动时对肠壁造成损伤，通过毒素作用以及机械刺激造成肠壁充血水肿而在宿主猴的大肠内壁上形成结节，这种结节的大量形成可导致宿主消化功能紊乱，吸收功能降低，最后引起宿主猴营养不良和脱水而死亡[6]。尖尾食道口线虫病有明显季节性，多发于春秋季节[7]，针对宿主没有明显的性别、年龄差异[8]。本研究中，该滇金丝猴生前食欲废绝，剖检见结肠外壁有纽扣大小的暗红色结节，结肠内壁有大量白色丝状虫体，长约8 mm～12 mm，将虫体取出进行处理后放置光学显微镜下观察，见其头部有发达的交合伞，背板两侧各有一乳突状突起，且有一对等长交合刺，交合刺上有横纹，与前人文献报道感染食道口线虫的临床症状基本一致[6,9]，可初步鉴定为食道口线虫感染；虫体经PCR扩增cox1基因[10]后测序比对结果显示也为尖尾食道口线虫，且相似度高达99.74%，从而进一步判定该滇金丝猴感染了尖尾食道口线虫。

▲本研究样品 Sample of this study

尖尾食道口线虫的感染通常是由于易感动物食用了被该虫第3期幼虫污染的土壤或食物引起的[10]。该虫在宿主体内的潜伏期为5周～7周[11]。由于金丝猴是群居动物，当个别猴误食尖尾食道口线虫卵后，通过一起玩耍、进食、抱团等形式，极易增大猴群间尖尾食道口线虫病的传播和感染概率[6]。本研究中，该滇金丝猴发病距被救助已经过去较长时间，因此推测该滇金丝猴有可能是在园区内误食了携带有感染性幼虫的食物引起发病。由于尖尾食道口线虫的幼虫能使结肠、盲肠段出现纤维包囊化结节，导致患病猴大肠蠕动能力减弱，消化能力下降，最终导致食欲废绝[12]。

做好预防措施能够有效的防止尖尾食道口线虫的感染。有文献表明，大部分食道口线虫的感染通常来源于不卫生、过于拥挤的环境中[13]，因此要对滇金丝猴的居住环境进行定期打扫，同时也要注意猴与猴之间的饲喂距离。虫卵会通过患病动物的粪便滞留于土壤甚至污染该区域内的食物，因此应当对园区内相关的粪污以及土壤及时进行清理和消毒，尤其是患病动物的粪便应进行无害化处理[14]。也应注意禁止游客随意投喂食物导致发病，同时在该寄生虫高发季节对易感动物进行驱虫。当发现其他猴类疑似症状时，立即采取相应的治疗措施，避免造成不必要的损失。

虽然食道口线虫通常只在反刍动物、猪和猴子中发现,但也有感染人的报道,特别是在非洲的某些地区具有很高的感染率[15]。而目前尖尾食道口线虫仅在亚洲有分布[16]，该病多发于灵长类[17]，其中猕猴的感染率最高[18]。在国内虽然目前暂未发现人类感染该寄生虫的病例，但由于该寄生虫与同一种属的人兽共患寄生虫猴结节线虫基因序列相似度较高，有人兽共患的风险[19-20]。

滇金丝猴作为我国一级珍稀濒危保护动物，仅在云南部分地区分布，种群数量非常稀少，其保护与健康问题任重而道远。本研究有利准确鉴别食道口线虫的种类，对患病滇金丝猴对症用药，且对于预防和规避人兽共患风险，保障人类健康和公共环境卫生有重要意义。