鼠作为猪繁殖与呼吸综合征病毒媒介动物的基本特性

吴晓傲，刘婉葶，单栢强，冯寿华，冯晓慧，魏 澍，吴洪涛，张 飞，沈国顺，陈泽良，刘金玲*

(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳 110866；2.辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳 110164)

猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)能够引起猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)，是目前危害养猪业的主要病毒性传染病。感染猪耳部发绀呈紫色，又称“猪蓝耳病”，首次报道于20世纪80年代，可感染不同年龄段的猪群，以妊娠母猪和初生仔猪最易感[1]。PRRSV分为基因Ⅰ型和基因Ⅱ型2个基因型，欧洲Lelystad virus 和美洲的VR2332分别是2个基因型的代表毒株。虽然2个基因型的基因组结构相似，但它们的核苷酸有着明显差异[2]。PRRSV的基因组片段大约15 kb，5′端有帽子结构以及非编码区(UTR)，3′端有poly(A)尾巴和UTR。从5′端到3′端有8个开放阅读框(ORFs)，分别是编码非结构蛋白的ORF1a和ORF1b，编码结构蛋白的ORF2-ORF7。其中GP2-GP5编码4种囊膜蛋白，ORF6编码非糖基化的M蛋白，ORF7编码N蛋白。GP5由ORF5编码，是一种由200个氨基酸组成的高度糖基化蛋白，具有很强的免疫原性，能够诱导中和抗体的产生。GP5与M蛋白形成异源二聚体，作用到唾液酸受体(Sn)，参与PRRSV对猪肺泡巨噬细胞的吸附与入侵[3]。因此，GP5常作为PRRSV新型疫苗的后选蛋白应用于PRRSV防控等研究中。NSP2是PRRSV粒子中由ORF1a编码的最易变异的最大非结构蛋白，参与病毒的复制过程[4]。2006年，几乎遍布全国各养猪场的“猪高热病”，就是PRRSV 的NSP2基因有30个不连续氨基酸的缺失，演变成高致病性PRRSV，导致较高的生猪死亡率，给养猪业造了巨大的经济损失[5]。NSP9和NSP10是PRRSV粒子中由ORF1b自身酶分割多聚蛋白pp1ab后形成的非结构蛋白，NSP9是PRRSV唯一的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，PRRSV NSP10含有NTPase/RNA解旋酶活性。研究发现，HP-PRRSV NSP9和NSP10与病毒的毒力相关，并且与病毒的复制具有十分紧密的联系，二者协同作用能够促进PRRSV的转录复制[6-7]。

PRRSV可经口、空气、接触及流产母猪的子宫内容物等多种途径感染易感猪，在病猪的鼻腔、粪便和尿液中均可检测到该病毒，因此有效的切断PRRSV的传播途径彻底根治PRRS面临的重要问题。为了降低PRRSV的传入风险，养殖企业采取严格的防控措施以增强猪场的生物安全性。然而，在全进全出的猪场中仍然经常发生PRRSV的感染，并且某些生物安全措施如在猪场的建筑物附近开口处放置防鸟网，并不能阻止小型啮齿类、昆虫等进入猪场。相关研究表明鼠、禽、蚊子和蝇能够携带PRRSV并能从其粪便中分离出PRRSV，使其成为PRRSV的新传播者或携带者[8]。因此，小型啮齿类、昆虫类等环境生物能否在猪群中传播PRRSV需要进一步的研究。为了初步评估环境中动物媒介传播PRRSV的潜在风险以及传播病原的分子生物学特点，本研究捕获猪场家鼠，收集小鼠粪便，提取RNA反转录后采用PCR方法，检测NSP10、ORF9、NSP5 和NSP2等PRRSV目的基因，测序后采用生物信息学软件分析鼠源和来源于同一猪场感染猪PRRSV NSP2、ORF5、NSP9和NSP10基因的遗传特性，从易感和非易感动物角度深入了解PRRSV的传播特性，为PRRSV的综合防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂及仪器设备 Trizol reagent试剂盒、2×TaqPlus Master Mix，诺唯赞工程(南京)有限公司产品；氯仿、无水乙醇，全式金(北京)生物有限公司产品；Hank's溶液，普洛恩(天津)科技有限公司产品；DEPC处理水、琼脂糖，电泳液，北京索莱宝科技有限公司产品；DNA分子质量标准DL 2 000、反转录试剂盒(RR047A)，Takara宝生物有限公司产品；PCR仪，赛默飞世尔科技公司产品；凝胶成像仪APLEGEN CA94107，Gel公司产品；电泳仪，美国伯乐公司产品。

1.1.2 样品 猪场猪源PRRSV阳性(RPV，CSFV和PCV阴性)病料、猪场家鼠肠道粪便，由沈阳农业大学畜牧兽医学院保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 NSP9、NSP10特异性引物参照文献[9]，用Primer 5.0软件参考NCBI GenBank登陆的PRRSV基因序列，设计NSP2、ORF5特异性引物、ORF5、NSP9、NSP10的套式引物，并送往鸿讯生物(苏州)有限公司合成。

1.2.2 猪场猪源和鼠源PRRSV RNA基因组的提取、反转录及目的基因扩增 将收集的家鼠肠道粪便样经Hank’s浸泡后取上清200 μL，小鼠的组织脏器和猪场猪源PRRSV阳性的猪淋巴组织各约0.528 g和2.016 g用液氮研磨成粉沫后分别置于1.5 mL除酶离心管，按照Trizol reagent试剂盒说明书提取样品RNA并进行反转录。参考R211-01/02反转录酶说明书将模板RNA反转录成cDNA后进行PRRSVNSP2、ORF5、NSP9、NSP10基因的PCR扩增。再分别取第一次PCR产物1 μL为模板，采用二次PCR方法或套式PCR扩增PRRSVNSP2、ORF5、NSP9和NSP10基因。取5 μL扩增产物，10 g/L琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统检测PRRSV目的条带，对PRRSV的PCR阳性产物送上海生工生物工程有限公司测序。

1.2.3 猪场猪源和鼠源PRRSV主要基因生物信息学分析 将测序获得的鼠源、猪场猪源PRRSVNSP2、ORF5、NSP9和NSP10基因序列与GenBank中登录的PRRSV毒株的相应基因，采用MEGA 5.0生物软件构建系统进化树，使用DNASTAR等生物软件分析氨基酸位点的变异情况。

1.2.4 猪场猪源和鼠源PRRSV主要差异基因编码蛋白的三维结构及理化特点分析 结合1.2.3的分析结果对猪源和鼠源PRRSV变异较大的差异基因用Interpro(https://www.ebi.ac.uk/interpro/)进一步分析氨基酸序列，并提交序列至Swiss-Model服务器预测蛋白三级结构，以Swiss-Model从蛋白质数据库(www.rcsb.org)获取适宜的晶体结构作为模板，结合Visual Molecular Dynamics 1.9.3软件展示和比较鼠源和猪源PRRSV主要差异蛋白的三维结构，通过计算蛋白结构域氨基酸组成的均方根偏差(Root-Mean-Square Deviation,RMSD)值评估结构的相似性，当2>RMSD>0，说明两个蛋白的结构相似。采用Protscale(https://web.expasy.org/)软件评估鼠源和猪源PRRSV主要差异蛋白的疏水性、亲水性以及功能性氨基酸的特点。

2 结果

2.1 猪场猪源和鼠源 PRRSV目的基因RT-PCR扩增结果

猪场猪源PRRSV阳性样本的NSP2、ORF5、NSP9、NSP10基因的RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示，分别在250、385、2025、1404 bp出现目的片段，与预期片段大小一致(图1)。鼠源肠道粪便以及粪便样本PRRSVNSP2、ORF5、NSP9、NSP10基因二次和套式PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示分别在250、258、529、498 bp出现目的片段，与预期片段大小一致(图2)。

M.DNA标准DL 2 000;A.1～2.猪源PRRSV NSP2和ORF5基因片段;3.空白对照;4.猪源PRRSV NSP10基因片段;5.空白对照。B.1.空白对照；2～3.猪源PRRSV NSP9基因片段

A.M.DNA标准DL 2 000; 1.鼠粪便源PRRSV NSP2基因片段；2.鼠肠道粪便源PRRSV NSP2基因片段；3.空白对照; B.M.DNA标准DL 1 000;1.鼠粪便源PRRSV ORF5基因片段；2.鼠肠道粪便源PRRSV ORF5基因片段；3.空白对照;C.1～3.鼠粪便源PRRSV NSP9基因片段；4～5.鼠肠道粪便源PRRSV NSP9基因片段；6.空白对照;D.1.鼠源粪便PRRSV NSP10基因片段；2.空白对照；3～4.正常鼠粪便

2.2 猪场猪源和鼠源PRRSV基因系统进化树分析结果

鼠源和猪场猪源PRRSV基因与GenBank登陆的PRRSV代表株进行遗传进化树分析(图3)，鼠源与猪源PRRSV NSP2、ORF5、NSP9和NSP10基因均为美洲基因型分支，与高致病性GDZQ、FZA06等毒株属于同一分支群，亲缘关系较近。而EuroPRRSV和Lelystad virus成独立分支群为欧洲基因型分支。

2.3 猪场猪源和鼠源 PRRSV基因氨基酸序列位点比较结果

鼠源、猪源以及其他PRRSV代表株基因编码的氨基酸序列比对结果显示，与其他PRRSV代表株相比，鼠源PRRSV NSP2基因第486位发生486Leu→ILe替换，第487位氨基酸缺失，猪源PRRSV NSP2基因与其他PRRSV代表株相比第486、487位氨基酸缺失(图3A)；鼠源PRRSV ORF5基因第36位氨基酸缺失，第27-28、30-35、101位发生27Val→Ala、28Leu→Ala、30Asn→Thr、31Ala→Pro、32Ser→Ile、33Asn→Ala、34Asn→Phe、35Asn→Phe、101Tyr→Phe替换；猪源PRRSV ORF5基因与FZ06、JXA1、GD、HUN4、JXWn06株氨基酸序列一致，无缺失替换(图3B)；鼠源PRRSV NSP9基因与猪源以及其他PRRSV代表株NSP9相比第151位氨基酸缺失；144-146位氨基酸发生144Leu→Lys、145His→Leu和146Cys→Tyr 的替换(图4C)；鼠源PRRSV NSP10基因第120位氨基酸缺失，第115-117、123、131、133位发生115Gln→Leu、116Trp→Pro、117Thr→Asp、123Thr→Ser、131Glu→Gly、133Asn→Asp替换，第269位有一个Pro氨基酸的插入；猪源PRRSV NSP10基因与其他PRRSV代表株相比第204、216位发生204Arg→His、216Trp→Arg替换(图4D)。

A～D.鼠源和猪场猪源PRRSV NSP2、ORF5、NSP9和NSP10基因与其他PRRSV代表株进化树分析

A.PRRSV NSP2基因氨基酸序列比对结果；B.PRRSV ORF5基因氨基酸序列比对结果；C.PRRSV NSP9基因氨基酸序列比对结果；D.PRRSV NSP10基因氨基酸序列比对结果

2.4 猪场猪源和鼠源PRRSV NSP10蛋白3D结构组成及无规则卷曲环差异分析

结合氨基酸分析的结果，选择变异差异比较大的PRRSV NSP10利用SWISS-MODEL模拟构建猪源和鼠源PRRSV NSP10蛋白的3D结构进行差异分析。结果显示猪场猪源和鼠源PRRSV NSP10蛋白均包含4个β折叠片和5个α螺旋(图5)，经VMD1.9.3计算2个PRRSV NSP10蛋白整体碳骨架的RMSD值是1.67<2，表明猪场猪源和鼠源 PRRSV NSP10蛋白具有相似的三级结构(图5B，5C)。但115-133位氨基酸形成的蛋白质无规则卷曲环区域，其碳骨架的RMSD值是3.32>2，提示氨基酸变异位点使二者在该结构区域存在较大的差异，图5A)。

A.鼠源和猪源PRRSV NSP10蛋白无规则卷曲；B-C.鼠源和猪源PRRSV NSP10蛋白α螺旋和β折叠片

2.5 猪场猪源和鼠源PRRSV NSP10蛋白3D结构域特点比较

Interpro对NSP10序列进一步分析的结果显示猪场猪源和鼠源的PRRSV NSP10蛋白由腺苷三磷酸酶和解旋酶2个结构域以及2个非酶结构域组成(图6)，非酶结构域通常具有调节Heli的功能。猪场猪源和鼠源PRRSV NSP10蛋白的Gln252、Pro151、Gly152、Ala153、Gly154、Lys155、Thr156、His157分别构成了相应蛋白的ATP结合位点，其中两者间151-157位氨基酸的RMSD值为0.094<2，位点225-229氨基酸组成DEAD样Helix超级RNA解旋酶结构域，其两者间RMSD值是0.49<2，表明该部分结构域具有相似的拓扑结构，有着较高的相似度(图6B，6C)。但是二者间的Gln252骨架原子Cα的原子距离是0.664 nm，表明猪源和鼠源PRRSV NSP10蛋白的Gln252存在较大的位置差异(图6A)。

A-B.鼠源和猪源PRRSV NSP10 ATP结合位点；C.鼠源和猪源PRRSV NSP10蛋白解旋酶蛋白结构

2.6 猪场猪源和鼠源PRRSV NSP10蛋白亲疏水性特点

猪场猪源和鼠源PRRSV NSP10蛋白总平均亲水性系数分别为0.047和0.043，属于疏水蛋白，表明二者具有相同的亲疏水性组成(图7)。

A～B.鼠源PRRSV NSP10蛋白亲疏水性；C～D.猪源PRRSV NSP10蛋白亲疏水性

3 讨论

PRRSV具有高变异、多样性的特点。变异产生的PRRSV变异株会改变病毒的生物学特性，也极易造成PRRS的大面积暴发。2006年4月我国各地养猪场广泛出现的高致病性猪蓝耳病变异毒株、2010年白俄罗斯出现的“丽娜”基因Ⅲ型新型变异PRRSV毒株，均导致了40%的仔猪发热死亡[10-11]。此外，在PRRSV传播途径的相关研究中表明，PRRSV的自然感染宿主猪、带毒猪、公猪精液和污染器具均可传播PRRSV。并且，三带喙库蚊也可传播或携带PRRSV，其他在动物体内还发现了PRRSV[12]。本研究以此为切入点，针对来源于猪场家鼠和同一猪场感染猪的PRRSV基因开展遗传特征分析，初步探讨小型啮齿类媒介动物在PRRSV传播中的特点和作用，为初步评价环境中动物性生物媒介机械传播PRRSV的潜在风险提供依据，这对提高动物健康水平具有重要的现实意义。

从PRRSV的起源分析，感染鼠类的小鼠乳酸脱氢酶病毒(Llactic dehydrogenase virus，LDV) 突变后成为LDV变异体，感染野猪后成为PRRSV的前体，经过若干年的进化成为能够感染猪的PRRSV，因此PRRSV有可能在鼠类体内复制[13]。基于此点推测，不同物种PRRSV细胞特异性受体的情况，表明不同物种的唾液酸受体(Sn)和CD163受体没有严格的宿主特异性，而且猪Sn与人和鼠Sn的同源性分别为78 %和69 %，说明鼠Sn和人Sn具备结合PRRSV的能力，进一步证实了不同物种Sn具有介导PRRSV进入细胞的可能性[14]。结合上述研究，本试验捕捉了猪场家鼠，在其肠道粪便中检测到了PRRSV的基因。测序分析结果显示，从进化树的关系来看来源于家鼠的PRRSV与来源于猪的PRRSV同属美洲群分支，且与高致病性PRRSV毒株同源关系最近。但来源于家鼠的PRRSV NSP2、ORF5、NSP9、NSP10基因与来源于同一猪场感染猪的PRRSV以及其他PRRSV代表株氨基酸之间存在不同程度的变异，有多个氨基酸位点的替换和缺失。初步认为PRRSV虽然与鼠乳酸脱氢酶病毒(LDV)具有较近的遗传关系，但在长期进化的过程中鼠并没有成为PRRSV的感染宿主，所以PRRSV在家鼠非易感宿主体内复制过程中产生了不同程度的变异，当然也不能排除PCR扩增过程中的错配现象。另外，本研究对猪场PRRSV阳性的猪淋巴组织采用RT-PCR方法分别扩增出了PRRSV的NSP2、ORF5、NSP9、NSP10基因，然而却采用套式PCR从鼠肠道粪便中检测到了PRRSVNSP2、ORF5、NSP9、NSP10基因。套式PCR本身是一种特异性高、灵敏性好的检测方法，检测病毒量可达到ng，比常规PCR灵敏度高100倍[15]。综上一步说明，虽然鼠Sn和猪Sn具有较高的同源性，但家鼠不是PRRSV的生物宿主，PRRSV在非猪宿主体内增殖复制力有限，导致病毒载量不高。

蛋白质三级结构是在二级结构的基础上按照一定的空间结构进一步盘绕折叠形成的特征三维结构。本研究对来源于家鼠和同一猪场感染猪样本中PRRSV两者之间变异较多的NSP10基因所编码蛋白的理化特性和三维结构进一步分析，结果显示来源于家鼠和猪的PRRSV NSP10 3D结构的结构域在组成上具有非常高的相似性。但位于Loop环的115-133位氨基酸的RMSD值是3.32，由此说明猪源和鼠源PRRSV NSP10蛋白的Loop区存在较大的结构组成差异，并且两者ATP结合位点的Gln252氨基酸的骨架原子Cα的原子距离是6.64Å，表明来源于家鼠和猪的PRRSV NSP10蛋白ATP区的Gln252间也存在较大的空间位置差异。Loop环突变是某些疾病早期诊断的重要指标，而Gln252是组成ATP结合位点的主要氨基酸[16]，这些差异是否会影响Gln252参与ATP的合成以及PRRSV生物学特性仍需要进一步研究。

任何生命都编码解旋酶，而编码解旋酶的基因具有相同起源。解旋酶与许多生物代谢过程有关，细胞可通过调控解旋酶来复制遗传物质，如病原体在细胞核中的复制等。PRRSV的NSP10具有解旋酶的特点。鼠、猪的生物内环境对解旋酶是否具有不同的调控特点，是否可能影响PRRSV 的复制，这些具体调控机制还需要后续进一步深入研究。此外，相关研究表明，HP-PRRSV的致病性和毒力与NSP9、NSP10具有相关性[17-18]。而在本研究中PRRSV基因序列中NSP9、NSP10的氨基酸存在不同程度的突变，这些突变是否会影响NSP9、NSP10毒力还不清楚，因为我们未曾从家鼠肠道粪便中分离出PRRSV验证PRRSV致病性的特点，但本研究结果是对媒介动物携带的PRRSV相关生物学特性研究的进一步补充。此外，课题组对多种媒介动物源PRRSV基因的分析结果发现，来源于其他物种的PRRSV基因的突变主要集中于结构域的功能位点(数据整理中，未发表)。家鼠虽然不是PRRSV的天然感染宿主，但家鼠能够携带PRRSV，PRRSV在家鼠体内产生的基因、氨基酸的突变、缺失是否会使PRRSV的生物学特性发生改变，并且这种PRRSV基因在自然环境、媒介动物体内的变异一旦整合鼠类等小型啮齿动物携带并传播病原的特性，是否会给公共卫生安全带来潜在危害，是值得进一步思考的问题。