急性溃疡性结肠炎昆明小鼠模型的制备与评价

杨 阳，周协琛，李 涛，李 炎，曹俊阳，赵 蕊

(黑龙江八一农垦大学，黑龙江大庆 163319)

溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)是一种症状极为隐匿且容易复发的炎症性肠道疾病，临床治愈难度大[1]。UC可分为急性发病和慢性缓解两个时期。UC在急性期可使患者腹部出现强烈疼痛感并伴随反复腹泻及便血现象[2]。目前临床治疗UC的药物主要包括氨基水杨酸盐、硫嘌呤及钙调磷酸酶抑制剂等[3]。但对于大部分患者而言，常规疗法并不能够完全控制疾病且往往存在不耐受、原发性无反应等问题，因此需要进一步研发以实现对UC的充分治疗。在临床研究过程中，理想的UC动物模型对于阐明UC的病因、发病机制以及开发有效治疗药物至关重要。目前，研究人员已开发出化学诱导、自发突变、过继性T细胞转移、微生物诱发等多种建立UC动物模型的方法[4]。其中化学诱导疾病模型因其造模成本低、可控性好等多种优点而被广泛应用。

葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS)是化学诱导方法中最常使用的试剂。在建模过程中，给予DSS的动物表现出体重减轻、腹泻、直肠出血的迹象且病灶部位与人类相似，因而可模拟UC的临床过程[5]。DSS诱导UC模型的有效性取决于多个因素，包括DSS浓度、给药的持续时间和频率、DSS的分子质量、动物的品系等[6]。通过调整给药浓度和给药频率，DSS可对小鼠、SD大鼠、兔、猪等多种实验动物建立急性、慢性和复发性肠道炎症模型[7]。C57BL/6、Balb/c等近交系小鼠因遗传背景稳定且对DSS敏感，常用于建立UC模型。但近交系小鼠存在体重小、生长速度缓慢、生活力弱的缺点[8]。昆明小鼠是一种源自瑞士白化鼠的外繁殖小鼠品系，在中国各地被广泛用作实验动物，具有生长速度快、适应力强、抗病性高等优点[9]。目前针对昆明小鼠品系建立UC模型的方法尚未见详细报道。本研究用DSS构建昆明雄鼠急性UC模型并对DSS的最佳浓度进行探索，为UC动物模型的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 32只SPF级雄性昆明小鼠，18 g～22 g，4周龄，由长春医科大学实验动物中心提供。

1.1.2 主要试剂 葡聚糖硫酸钠，MP公司产品；100 mL/L中性福尔马林固定液，Solarbio公司产品；二甲苯，阿拉丁公司产品；无水乙醇，天津大茂公司产品；石蜡，Leica公司产品；伊红、苏木精，Biosharp公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 H20-MA-T型超纯水分离系统，Sartorius公司产品；AL204型精密称量天平，Mettler Toledo公司产品；RM2235型切片机，Leica公司产品；DKB-501A型超级恒温水浴锅，上海叶拓公司产品。

1.2 方法

1.2.1 急性UC模型的制备 SPF级环境下，给予小鼠充足的粮和水，适应性饲养3 d后，将32只小鼠均分为空白组和30、40、50 g/L DSS组，确保各组小鼠体重平均值基本相同。按照质量体积比将DSS添加到高压蒸气灭菌的饮用水中至所需的最终浓度。称取3 g DSS粉末，充分溶解于100 mL无菌水中，即得30 g/L DSS溶液。40 g/L DSS、50 g/L DSS配置方法同上。DSS溶液均现用现配。适应期结束后，各组小鼠按照每只每天5 g粮、每只每天5 mL水的方式定量饲喂，期间对照组自由饮用无菌水，剩余3组设置不同浓度的DSS水溶液供自由饮用。此外，为保证DSS药效，需每隔2 d重新配置DSS液。在第7天对所有小鼠断食处理24 h，并于第8天处死各组小鼠(图1)。

图1 DSS诱导小鼠急性溃疡性结肠炎模型示意图

1.2.2 表观差异检测 每天称量各组小鼠的体重并观察腹泻和便血情况。根据小鼠体质量变化情况、腹泻情况及便血情况这3项指标，及时统计疾病活动指数(disease active index，DAI)评分。根据以往文献对DAI评分规则进行适当优化[10]。具体评分细则为：若小鼠体质量下降小于1%，无腹泻，无便血，则每项分值为0分；若小鼠体质量下降5%，粪便为软颗粒，粪便潜血，则每项分值为1分；若小鼠体质量下降在5%～10%，粪便为黏附在肛门上非常软的颗粒，视觉颗粒性出血，则每项分值为2分；若小鼠体质量下降在10%～15%，粪便为湿软、深红色呈溪流状的长便，肛周处有血液，则每项给与3分；若小鼠体质量下降大于15%，腹泻，大出血，则每项分值为4分。最终DAI分值=(体质量下降分值+腹泻情况分值+便血情况分值)/ 3。

1.2.3 结肠病理切片观察 处死各试验组小鼠，无菌条件下开腹取样。剪取各组小鼠盲肠至肛门处的肠道组织，测量该肠段长度。每只小鼠取1 cm左右的远端结肠组织并用生理盐水将内容物冲洗干净，然后依次按照固定、脱水、透明、浸蜡、包埋的程序制备石蜡组织块，具体操作步骤如下。①固定:事先准备好100 mL/L福尔马林溶液，将修剪过的结肠组织放在其中24 h，然后置于烧杯内流水冲洗6 h。②脱水：按照700、800、900、950 mL/L乙醇、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ各级浸泡2 h的方式对结肠组织样品进行梯度脱水。③透明:将脱水的结肠组织转移到无水乙醇和二甲苯的混合溶液中，浸泡过夜后转移到二甲苯溶液中，浸泡2 h后更换新的二甲苯溶液，再次浸泡2 h。④浸蜡：将透明后的结肠样本在已熔好的二甲苯和纯蜡混合溶液、纯蜡溶液Ⅰ、纯蜡溶液Ⅱ中各浸泡2 h以使结肠组织充分浸蜡。⑤包埋：将结肠组织垂直立于金属包埋模具中，倒蜡并放上组织包埋盒，及时补蜡，待蜡完全凝固脱模后即得石蜡组织块。

修剪蜡块并将组织块切成若干张约7 μm的石蜡切片。组织片于42℃水浴锅中展至平整无褶皱后，用载玻片捞片。将载玻片置于50℃烘箱内烘烤2 h以去除残留水分。依次按照脱蜡、复水、染色、脱水、封片的程序对组织进行染色。①脱蜡：将载玻片置于二甲苯溶液Ⅰ中浸泡10 min，随后将其取出转移至二甲苯溶液Ⅱ，浸泡10 min。②复水：载玻片依次在1000、950、900、800、700 mL/L乙醇溶液中浸泡10 min。③染色：使用苏木精避光染色4 min，置于流水中冲洗3 min；再用10 mL/L 盐酸醇溶液分化10 s，再次流水冲洗3 min；然后用10 mL/L氨水返蓝10 s，用流水冲洗3 min；最后用伊红复染3 min。④脱水:将载玻片分别在900 mL/L、950 mL/L、无水乙醇Ⅰ和无水乙醇Ⅱ中浸泡2 min，然后分别在二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中浸泡2 min。⑤密封:在切片中加入中性胶，然后加入盖玻片。用镊子轻轻按压盖玻片以驱赶气泡。观察结肠组织形态，根据溃疡部位、炎症浸润程度及上皮细胞变化情况3项指标予以评分。具体评分细则如下：黏膜无溃疡、无炎症、上皮细胞正常，每项得分为0分；黏膜局部溃疡、隐窝周围炎症浸润、杯状细胞缺失，每项得分为1分；黏膜大面积溃疡、浸炎症润至黏膜下层、杯状细胞大面积缺失，每项得分为2分；黏膜下层溃疡、炎症浸润至黏膜基底层、隐窝缺失，每项得分为3分；黏膜透壁性溃疡、透壁性炎症浸润、隐窝大面积缺失并出现息肉，每项得分为4分。最终病理组织学指数(Histopathological index，HI)得分为3项分数的平均值[11]。

1.2.4 数据统计学处理 使用SPSS 19.0软件进行统计学分析。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。用GraphPad Prism 8及Origin绘图，图中#表示和空白组相比P<0.05，##表示P<0.01，###表示P<0.001。

2 结果

2.1 不同浓度DSS对小鼠体重的影响

与体重稳定增加的空白组相比，30 g/L DSS的体质变化率在第5天开始出现显著性差异，40 g/L DSS和50 g/L DSS组小鼠的体质变化率在第4天开始出现显著性差异，且较30 g/L DSS组体重下降幅度更大(图2)。表明DSS处理以剂量依赖性方式显着降低小鼠的体重。

图2 不同浓度DSS对小鼠体质量变化率的影响

2.2 不同浓度DSS对小鼠腹泻情况的影响

自由饮用灭菌蒸馏水的小鼠粪便干燥致密，色泽较深，整体形态呈颗粒状，试验期间无腹泻情况发生。与空白组相比，30 g/L DSS组小鼠的粪便略为湿润，表面可见少量黏液附着，质地疏松，黏度及硬度有所下降，整体形态不完整，粪便颜色略变浅且可见斑驳红色血迹。40 g/L DSS组小鼠的粪便质地湿软松散，整体呈黏液样且易黏附于肛门上，粪便颜色进一步变浅，血迹明显，腹泻情况更为严重(图3)。50 g/L DSS组小鼠粪便呈棕黄色稀血便，腹泻最严重。表明自由饮用DSS可引起小鼠不同程度的腹泻，且腹泻程度与DSS浓度呈正相关。

A.空白组；B.30 g/L DSS；C.40 g/L DSS；D.50 g/L DSS

2.3 不同浓度DSS对小鼠便血情况的影响

空白组小鼠肛门形态完好，无泛红、肿涨等炎症表现，肛周无血迹(图4)。与空白组相比，DSS处理组均出现不同程度的肛门红肿及便血的现象。其中40 g/L DSS组有明显的肛门肿胀和便血，50 g/L DSS组最严重。排便时可见肛门直肠脱垂，肛门内有大量血液残留。表明不同浓度的DSS以剂量依赖的方式影响小鼠粪便中的血液程度。

A.空白组；B.30 g/L DSS；C.40 g/L DSS；D.50 g/L DSS

2.4 不同浓度DSS对小鼠DAI指数的影响

根据体质量下降情况、腹泻情况及便血情况计算得到DAI指数(图5)。在造模期间，空白组小鼠一直处于健康状态，DAI指数为0。与空白组相比，不同浓度DSS处理后的小鼠DAI指数均显著升高，且相比于30 g/L DSS组、40 g/L DSS及50 g/L DSS组小鼠DAI指数更高，表现出更明显的急性UC的特征。

图5 不同浓度DSS对小鼠DAI指数的影响

2.5 不同浓度DSS对小鼠结肠长度的影响

空白组小鼠结肠内粪便呈颗粒状，结肠无充血、水肿等炎症表现；30 g/L DSS组结肠缩短(图6)，结肠内粪便湿软呈溪流状；40 g/L DSS组小鼠结肠缩短更加明显，部分溃疡表面可见坏死组织；50 g/L DSS组小鼠结肠表面出现明显弥漫性水肿、溃疡等结肠病变，结肠萎缩最为严重。DSS以剂量依赖性方式显著诱导小鼠UC样结肠病变。

图6 不同浓度DSS对小鼠肠道长度的影响

2.6 不同浓度DSS对小鼠结肠组织形态的影响

空白组小鼠隐窝结构正常，杯状细胞丰富，肠黏膜完整，黏膜下层、肌层以及浆膜层均无炎症浸润现象(图7)。与空白组相比，不同浓度DSS均在不同程度上破坏了结肠组织形态。30 g/L DSS组小鼠结肠组织病变情况相对较轻，结肠黏膜形态并未严重受损，基本保持完整；40 g/L DSS组结肠组织病变严重，炎性细胞已浸润至黏膜下层和浆膜层，黏膜层几乎完全脱落，隐窝和上皮细胞结构基本消失；50 g/L DSS组较40 g/L DSS组病变更为严重。

A.空白组；B.30 g/L DSS；C.40 g/L DSS；D.50 g/L DSS

2.7 不同浓度DSS对小鼠HI指数的影响

不同浓度DSS处理组HI 指数均与空白组差异显著(图8)，且40 g/L DSS和50 g/L DSS组小鼠的HI指数较30 g/L DSS组更高，这表明40 g/L DSS和50 g/L DSS组小鼠结肠损伤更为严重。表明不同浓度均可对小鼠结肠组织造成损伤，但30 g/L DSS组小鼠结肠炎症较轻，不具备明显的急性UC的特征，而40 g/L DSS组与50 g/L DSS组小鼠结肠病变严重，表现出明显的急性UC的特征。

图8 不同浓度DSS对小鼠HI指数的影响

3 讨论

UC是由多种因素引起的慢性炎症性肠道疾病[12]。UC动物模型是探究UC发病机制及评估药物疗效的基础，目前已开发出免疫造模法、化学诱导法等多种具有类似于UC特征的结肠炎动物模型。UC的免疫造模法主要有结肠黏膜组织致敏法、胎鼠结肠种植法及致敏物质造模法。其中结肠黏膜组织致敏需要收集动物或人体的新鲜结肠黏膜组织，在制成匀浆的组织中加入弗氏佐剂，乳化后取0.1 mL～0.3 mL注射于大鼠足跖内[13]。第1次注射后10 d进行第2次注射，17 d后背部进行第3次注射，24 d后腹股沟进行第4次注射，31 d后将组织匀浆注入腹腔进行最后注射。该模型需要充分研磨结核菌和乳化弗氏佐剂，操作复杂且重复性差，目前已很少使用。胎鼠结肠种植法是在成年鼠的肾包膜下移植同系胎鼠的结肠，使鼠发生宿主抗移植免疫反应从而建立UC模型的方法。具体操作为：戊巴比妥钠腹腔麻醉成年大鼠，在成年鼠右肾包膜下无菌移植从受孕14 d～18 d的孕鼠中取出的3 cm～4 cm胎鼠结肠。21 d后，剖检动物，宿主小鼠结肠黏膜出现大面积溃疡，胎鼠结肠黏膜腺严重萎缩，伴有单核细胞浸润和纤维结缔组织增生。胎鼠结肠植入模型与慢性UC的临床症状有许多相似之处，但其试验周期长，成功率低，因此适用于慢性炎症和特异性药物筛选[14]。致敏物质的方法是用致敏化学物质诱导溃疡性结肠炎的方法。二硝基氯苯是一种常用的致敏化学试剂，可用作半抗原与组织蛋白结合，引发T细胞依赖性免疫反应，从而诱发UC[15]。用二硝基氯苯构建UC模时，需先在动物背部及腹部皮肤涂擦二硝基氯苯液，待动物对其致敏后即在肠道内滴注二硝基氯苯液以激发肠黏膜的炎症反应。二硝基氯苯模型具有可重复性且结肠病理改变与人类UC相似，但由于肠内滴注二硝基氯苯液对手法要求较高，目前应用较少。

化学建模法是利用化学物质对肠黏膜的刺激作用建立UC模型。用于建立UC模型的化学物质包括角叉菜胶、葡聚糖硫酸钠、乙酸、三硝基苯磺酸等[16]。最为常用的UC模型是化学诱导的肠道炎症模型。而在各种化学诱导的结肠炎模型中，DSS诱导的结肠炎模型因其简单性、可控性以及与人类UC的高度相似性而被广泛使用。DSS是一种水溶性的带负电荷的硫酸盐多糖，由氯磺酸和葡聚糖的酯化反应形成。研究表明，DSS诱导小鼠UC的机制与其对结肠上皮细胞的毒性有关[17]。DSS携带由硫酸基团贡献的高度负电荷，带负电荷的DSS可通过排斥力破坏带负电荷的细胞膜，诱导侵蚀结肠上皮，增加了结肠上皮的通透性，并最终损害了结肠黏膜的完整性。此外，DSS因其抗凝血的特性也可进一步加剧了肠道出血的症状，最终诱使小鼠表现出人类UC的特征。

DSS的分子质量可影响DSS的诱导效果，目前市面上DSS的分子质量分别为4 ku～6 ku、36 ku～50 ku及40 ku～60 ku。由于低分子质量DSS的炎性作用较弱，而高分子量DSS在体内吸收较困难，因此本研究选用36 ku～50 ku的DSS建立小鼠UC模型。UC模型有急性、慢性之分。急性UC模型通常由高浓度DSS诱导，DSS浓度通常为3%～5%，给药周期集中在7 d～10 d；慢性UC模型使用低浓度DSS长期刺激动物，DSS的浓度通常为1%～3%，给药期可达50 d～60 d[18]。急性UC模型典型的组织学改变主要表现为上皮糜烂、杯状细胞耗竭及炎性细胞的大量浸润。然而，慢性UC模型通常有其他组织学改变，如隐窝脓肿、直肠黏膜鳞状上皮化生、腺瘤样病变等。李兰珍等[19]通过让大鼠自由饮用20 g/L DSS 7 d，随后自由饮用无菌水14 d，连续3个周期后成功建立了Wistar大鼠慢性UC模型。为探讨参苓白术散对UC的干预作用，马琪等[20]对雄性Balb/c小鼠连续7 d给予35 g/L DSS，成功建立了Balb/c小鼠急性UC模型。由此可知，改变DSS的给药频率及给药浓度可以诱使小鼠表现出不同时期的UC特征。

本研究用36 ku～50 ku DSS自由饮用7 d的方式诱发急性结肠炎，并设置30、40、50 g/L 3个DSS浓度梯度，以探究建立昆明小鼠UC模型的最佳DSS浓度。结果表明，30、40、50 g/L DSS均可使小鼠出现不同程度的体重下降、腹泻、便血等疾病状态，显著升高DAI 指数。但从结肠组织形态来看，30 g/L DSS组小鼠有轻度结肠炎，不具有明显的急性UC特征。而与30 g/L DSS组相比，40 g/L DSS与50 g/L DSS组小鼠均表现出急性UC的特征，且50 g/L DSS组比40 g/L DSS组炎症更为强烈。在试验过程中50 g/L DSS组小鼠死亡数量较多，因此本试验认为40 g/L DSS为小鼠急性结肠炎最佳建模浓度。