细菌脂多糖对猪圆环病毒2型在PK-15细胞中复制的影响

张歆明，徐 舸，郑钦生，刘献辉，张鹏飞，王爽云，张乐宜，刘燕玲，宋长绪*

(1.华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心，广东广州 510000；2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广东广州 510000；3.华南农业大学食品学院，广东广州 510000)

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是一种小的无襄膜的单链环状DNA病毒[1]。主要引起“猪圆环病毒相关疾病”(Porcine circovirus-associated diseases,PCVAD),该病的主要临床症状表现为仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Post weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)和繁殖障碍相关疾病,虽然针对PCV2的多种疫苗已经被广泛使用，但是由于其复杂的免疫逃逸机制和变异株的不断产生，致使病毒很难被有效的防控，对全世界养猪业都造成严重的影响。PCV2经常与许多致病菌和病毒共感染，而且与单独感染相比，共感染表现出更加严重临床症状。有研究表明，PCV2单独攻毒时是很难出现典型的病理症状，但是在与其他病原体如猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)[2]、猪细小病毒(PPV)[3]、猪肺炎支原体(Mycoplasmal hyopneumonia)[4]，以及其他致病细菌混合感染或使用免疫刺激因子都会诱导严重的PMWS，这表明免疫刺激辅助因素对PCV2致病性是至关重要的[5]。

细菌脂多糖(lipoolysaccharide,LPS)存在于革兰氏阴性菌的外膜,一般在细菌死亡后脱落下来发挥毒性作用，是免疫系统最有效的诱导因子之一[6]。其与细胞复杂的“模式识别受体”级联识别，主要与Toll样受体4 (TLR4)-MD2复合物结合，由LPS结合蛋白(LBP)和CD14共同催化，激活多种细胞内信号通路[7]。有报道称LPS激活NF-κB信号通路，诱导白细胞介素(IL)-1、IL-2、IL-8，干扰素(IFN)-β和肿瘤坏死因子(TNF)-α[8]的产生。而NF-κB调节多种基因参与免疫和急性期炎症反应和细胞生存。NF-κB信号通路的激活以及IFN-β的产生均可以促进PCV2的复制[9-11]。还有研究表明IL-2过表达后也可以促进PCV2的复制[12]。因此，刺激猪免疫系统会诱导干扰素和白介素产生可能是导致PCV2在体内复制增加的关键，而理论上LPS可能是通过激活NF-κB信号通路，致使免疫系统激活，促进IFN-β产生导致PCV2复制的增加。然而，我们研究发现LPS对PCV2复制的影响具有双重效果。

本文研究LPS对PCV2复制的影响，发现 LPS的确可以显著激活NF-κB信号通路，促进IFN-β和IL-2的表达，从而促进PCV2的复制，值得注意的是，研究发现LPS处理前期是抑制PCV2复制的，深入研究表明LPS抑制PCV2的吸附，阻止PCV2进入细胞，而后期随着IFN-β的产生，病毒滴度又显著升高。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和细胞 PCV2病毒，PK-15细胞，华南农业大学国家生猪种业工程技术研究中心猪病防控实验室保存。

1.1.2 试剂 LPS(大肠埃希氏菌)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；LPS(沙门氏菌)，上海善然生物科技有限公司产品；干扰素β，武汉云克隆科技股份有限公司产品；高糖DMEM培养基，胎牛血清，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；双荧光报告基因试剂盒，上海碧云天生物技术有限公司产品；CCK-8细胞增殖及毒性检测试剂盒，MCE公司产品；病毒总核酸快速抽提试剂盒，广州美基生物科技有限公司产品；SteadyPure通用型RNA提取试剂盒，Evo M-MLV反转录试剂预混液，湖南艾科瑞生物工程有限公司；；Eastep®qPCR Master Mix(2X)，普洛麦格(北京)生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 荧光定量PCR检测仪，美国应用生物系统公司产品；细胞培养箱，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；高速冷冻离心机，德国艾本德公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成 从GenBank数据库中下载各基因序列，并用Primer 5生物软件设计，在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列和GenBank序列号见表1。

表1 引物序列

1.2.2 PK-15细胞培养 从液氮中取出冻存的PK-15细胞，37℃迅速水浴回温，离心丢弃冻存液，加入100 g/L FBS高糖DMEM培养基，置于37℃、体积分数为5% CO2培养箱进行培养，待细胞长满后进行传代。细胞传代，首先弃瓶内的培养基，用已灭菌的PBS缓冲液清洗细胞3次，加入2.5 g/L胰酶进行消化，待细胞脱落后按照1∶3比例传代，多余细胞可进行后续细胞试验。

1.2.3 PCV2病毒接种 待细胞长至80%～90%时进行PCV2病毒接种，用20 g/L FBS高糖DMEM培养基稀释病毒(MOI=1的病毒感染剂量)，将病毒液完全均匀覆盖细胞表面，放入37℃、体积分数为5% CO2培养箱进行孵育1 h，随后用PBS缓冲液润洗3次，换成新鲜20 g/L FBS高糖DMEM培养基维持液继续培养。

1.2.4 LPS对PK-15细胞活力试验 用CCK-8试剂盒进行LPS细胞毒力检测，操作方法严格按照产品说明书进行，将细胞铺到96孔板中，待细胞长至90%时，使用不同浓度的LPS(50、100、200、500、1 000、2 000 ng/mL)进行刺激，孵育24 h后，加入CCK-8试剂，37℃孵育1 h，用酶标仪在450 nm测定吸光度，对结果进行分析。

1.2.5 病毒吸附和内化试验 将长至90%的细胞放入4℃预冷30 min，丢弃原有培养基，进行接毒，放入4℃环境中2 h，用提前预冷的PBS培养基进行润洗3遍，清除未吸附的病毒粒子,使用病毒核酸提取试剂盒提取核酸，实时荧光定量PCR检测吸附结果。用不同处理对病毒吸附影响试验，处理1：用500 ng/mL的LPS在37℃孵育细胞1 h后，PBS润洗3遍后进行吸附试验；处理2：用50 ng/mL的LPS与PCV2病毒孵育1 h后，加入细胞中4℃孵育1 h；处理3：用500 ng/mL的LPS与PCV2病毒孵育1 h后，加入细胞中4℃孵育1 h，用实时荧光定量PCR检测病毒拷贝数，分析试验结果。

1.2.6 双荧光报告基因检测 构建靶向NF-κB和IFN-β基因的启动子基因序列连接到pGL3-basic质粒荧光素酶表达质粒上，成功得到pGL3-basic-NF-κB和pGL3-basic-IFN-β质粒，待PK-15细胞密度在60%时，将转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染细胞内，24 h后用500 ng/mL LPS刺激细胞，收集12 h、24 h和48 h的细胞样品，加入裂解液冰浴5 min，充分离心去细胞上清液备用，配制萤火虫荧光素酶反应工作液和海肾荧光素酶反应液，各取100 μL先后加入到20 μL细胞裂解液中，充分振荡混匀，反应5 min后，分别在560 nm和465 nm波长采集荧光信号，分析试验结果。

1.2.7 实时荧光定量PCR检测 将待测细胞培养液吸出，PBS缓冲液润洗2遍，加入适量的细胞裂解液，随后按照动物细胞RNA提取试剂盒操作步骤进行操作，提取细胞RNA,使用Evo M-MLV反转录试剂盒进行反转录(10 μL的体系:5× Evo M-MLVRT Master Mix 2 μL,总RNA 500 ng,无核酸酶水加至10 μL,37℃ 15 min，85℃ 5 s)，反转录产物作为定量检测模板，配制定量体系，总体系20 μL(Eastep®qPCR Master Mix 2× 10 μL,DNA模板2 μL,上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,无核酸酶水7.2 μL，95℃ 2 min，40个循环，95℃ 15 s，60℃ 50 s)，放入定量PCR仪中进行扩增，分析结果。

2 结果

2.1 LPS在对PCV2在PK-15细胞复制的影响

LPS对PK-15细胞毒性试验结果见图1，仅在2 000 ng/mL时沙门氏菌来源的LPS出现细胞毒性，其他浓度均无明显的细胞毒性。随后用安全浓度为500 ng/mL的来源于大肠埃希氏菌和沙门氏菌的LPS处理细胞，验证不同时间对PCV2复制情况的影响(图2)，从PCV2的Cap基因的相对表达量来看,接毒后12 h，LPS均显著抑制了PCV2的复制，而24 h和48 h又显著促进了PCV2的复制，经3次重复，结果一致。

图1 LPS对PK-15细胞活性的影响

图2 不同时间点LPS对PCV2在PK-15细胞复制的影响

2.2 LPS抑制PCV2病毒的吸附

PCV2从侵入细胞到复制出新的子代病毒，至少需要18 h[13],在12 h抑制PCV2复制可通过抑制第1代PCV2病毒的吸附和内化来实现。本研究吸附试验表明(图3)，LPS可以抑制PCV2病毒的吸附和内化。影响PCV2吸附存在两种可能，一是LPS直接与PCV2病毒粒子相互作用，抑制其与受体结合；或者LPS竞争PCV2的细胞受体发挥作用，为验证LPS的作用，设计不同处理方式(图4),与PCV2正常孵育细胞相比，用500 ng/mL LPS孵育细胞后接毒组未出现明显差异，而LPS与PCV2孵育后接毒明显抑制病毒的吸附,并且随着浓度的增加，抑制效果更加明显。表明LPS可能直接与PCV2病毒有相互作用，抑制病毒与细胞受体相互作用。

图3 LPS对 PCV2吸附的影响

1.对照组；2.处理1；3.处理2；4.处理3

2.3 PCV2 Cap蛋白与LPS分子对接

用Pymol软件进行分子对接，从Uniprot数据库中查询PCV2蛋白序列，从PubChem数据库中下载LPS分子结构，用Pymol软件进行预测绘制两者相互作用图。选取亲和力较高的结果进行对接，提示两者存在相互作用的可能，并且具有多处结合位点(图5)。

图5 LPS与PCV2的Cap蛋白分子对接图

2.4 LPS促进TLR4的表达以及 NF-κB和IFN-β基因的转录

LPS是通过TLR4识别后，激活NF-κB信号通路，促进IFN-β产生。LPS刺激PK-15细胞后显著促进TLR4的mRNA的表达，而PCV2感染并不影响其表达量的变化(图6)。双荧光报告基因试验显示(图7)，与对照组相比，在LPS刺激和病毒感染后12 h和24 h，NF-κB转录水平明显增加，在48 h促进效果不明显；同时IFN-β转录水平在各个时间点均有明显提高，所以LPS可以激活NF-κB和 IFN-β基因的转录，表明PCV2和LPS均能激活NF-κB信号通路，促进IFN-β的转录。

图6 LPS促进TLR4的mRNA表达

图7 LPS刺激与PCV2感染促进NF-κB,IFN-β基因转录

2.5 IFN-β促进PCV2 的复制

为了进一步验证LPS后期促进PCV2的复制与IFN-β产生相关，用猪源的500 ng/mL IFN-β加入接毒后的PK-15细胞培养液中，结果表明，与对照组相比，PCV2的复制情况在12 h没有明显差异，24 h后逐渐显现IFN-β促进PCV2复制，在48 h促进效果达到2.5倍之多(图8)。

图8 IFN-β处理PK-15细胞促进PCV2的复制

3 讨论

PCV2病毒是目前基因组最小的病毒之一[14]，同时也是进化最成功的病毒之一，能充分利用自身遗传序列，推测至少编码11个开放型阅读框(ORFs)，其中只有4个用于蛋白质的表达，分别为Cap蛋白、Rep蛋白、ORF3蛋白和ORF4蛋白，这些蛋白在满足自身增殖功能的同时，还可以逃避宿主的先天性免疫反应[15]。PCV2被认为是免疫抑制病原体，感染后会增加感染其他病原的风险[16]。有研究称PCV2与革兰氏阴性菌等共同感染可能是促进PCV2复制的重要因素，至少部分地促进了PMWS的全面发展[2]。临床上PCV2常与副猪嗜血杆菌、大肠埃希氏菌和沙门氏菌混合感染，并且表现出更加严重的症状，这其中很大程度上在于LPS引起的免疫系统的激活有关[17]。尤其是促进了IFN-β和IL-2的表达，可以显著促进PCV2的复制，深入研究PCV2病毒可以发现，该病毒有许多异于其他病毒的地方，NF-κB信号通路激活是宿主用于清除致病微生物的利刃，但是可以被PCV2所利用，当该通路受到抑制时，反而抑制了病毒的复制。而且具有抗病毒作用的干扰素(IFNα，IFN-β，IFN-γ)及白介素(IL-2)却可以促进病毒的复制[11,18]。

LPS作为免疫激活剂，可以激活TLR4-NF-κB信号通路从而促进IFN-β产生促进PCV2在PK-15的复制，然而，在本文中发现LPS本身可能与PCV2蛋白Cap存在相互作用，抑制PCV2被受体识别，从而达到抑制病毒吸附的效果。而且LPS与PCV2的Cap蛋白有多处结合位点，为了排除偶然性，用了来自不同细菌的LPS进行试验，重复3次，均发现在12 h，明显抑制PCV2的病毒滴度，这与后期的促进现象看似矛盾，却也可以合理的解释：在加入LPS前期，LPS与部分PCV2病毒粒子相互作用，抑制了部分病毒的吸附作用，而未相互作用的LPS与病毒粒子被相应受体识别，PCV2完成吸附和内化，释放核酸进行后续的复制，而LPS可以促进TLR4的表达，并且通过TLR4激活NF-κB等相关信号通路，致使细胞释放多种炎性因子，其中包括IFN-β和IL-2等，可以促进PCV2的复制，随着LPS浓度逐渐降低和失效，后期促进效果明显。另外，LPS与PCV2的核衣壳蛋白Cap在结构功能预测存在多处结合位点，具体机制还需进一步验证，这一现象也为研发PCV2抗病毒药物提供思路。

本文揭示了LPS对PCV2复制的影响，提示LPS自身存在抑制PCV2病毒吸附的功能，这将为开发抗PCV2病毒药物提供参考。LPS会激活TLR4-NF-κB-IFN-β信号通路，促进多种炎性因子的表达，促进PCV2的复制，提示PCV2与细菌或其他病毒共感染可能会促进病毒的复制，放大免疫反应，进一步加重临床症状；在构建PCV2发病模型时，加入LPS作为免疫刺激剂时，要注意引入的顺序和时间。