同源异形盒基因A1在结肠癌组织中的表达及临床意义

姜韬，马丽园，邢林帅，赵立鹏，叶子琪，马硕，师新荣 .宁夏医科大学总医院结直肠外科，宁夏 银川 750004；.宁夏医科大学总医院超声科，宁夏 银川 750004；.宁夏医科大学研究生院，宁夏 银川 750004

世界范围内，结肠癌是发病率排序第三的恶性肿瘤，复发和转移是导致根治术后生存率降低的主要因素，鉴定新型治疗靶标对结肠癌个体化治疗及预后具有重要意义[1-3]。同源异形盒基因A1 (homeobox A1，HOXA1)属于HOX 转录因子家族，位于人染色体7p15.2基因编码区，是细胞分化、DNA修复、细胞凋亡等生物学行为的关键调节基因，其表达异常会引起个体发育和组织器官形成过程中出现异常形态结构，与肺癌、黑色素瘤、胰腺癌等恶性肿瘤的发生发展密切相关[4-5]。目前HOXA1 与结肠癌的关系尚未见报道。本研究旨在明确HOXA1 在结肠癌组织中的表达情况，探讨其在结肠癌发生发展中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 一般材料 (1)结肠癌新鲜冰冻组织：随机选取2021 年3～10月宁夏医科大学总医院结直肠外科手术切除结肠癌样本66 例，其中右半结肠41 例，左半结肠25例。同时取距癌灶边缘最远处(至少＞5 cm)正常结肠组织作为对照。取材后将标本冻存管立即置于液氮中，登记信息并最终保存于-86℃低温冰箱中。所有样本病理最终确诊为结肠腺癌，术前均未行新辅助化疗。66例患者中Ⅰ期2例，Ⅱ期27例，Ⅲ期34例，Ⅳ期3例。(2)结肠癌石蜡组织芯片(tissue microarray，TMA)：由课题组构建完成，所有结肠癌组织及配对正常结肠组织均取自于宁夏医科大学总医院结直肠外科手术病例标本库，一套组织芯片共13 张，由203 例结肠癌+结肠正常组织构成。其中男性110 例，女性93 例；年龄21～88 岁，中位平均63.5 岁；AJCC 分期：Ⅰ期24例，Ⅱ期81例，Ⅲ期80例，Ⅳ期18例(均存在远处脏器转移)。组织学分型：高分化腺癌100 例，中分化腺癌35 例，低分化腺癌68 例。所有病例资料TNM分期参照结直肠癌(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南[6]。本研究获得宁夏医科大学总医院伦理学会批准，患者及家属对本研究知情并签署相关知情同意文件。

1.2 试剂与方法

1.2.1 试剂 RT-qPCR 引物由上海生工公司合成，RNeasy protect Mini kit(Qiagen，德国)，反转录RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific，美国)，PCR 试剂盒SYBR Green qPCR Master Mixes (Thermo Scientific，美国)，Anti-HOXA1 抗体(ab230513，Abcam)，免疫组化EnVisionTMDetection Kit (Dako，丹麦)，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(Beyotime，中国)。

1.2.2 方法 (1)RT-qPCR：组织RNA提取参照试剂盒说明，紫外分光光度计检测260 nm和280 nm处的吸光度值，检测RNA的纯度。通过反转录反应以Oligo(dT)15为引物，由Total RNA的3’Poly(A)区域引导出cDNA，以cDNA 产物为模板，设计合成PCR 引物：HOXA1 Forward primer：5'-CGGCTTCCTGTGCTAAGTCT-3'，Reverse primer：5'-TTCATTGTGCCATCCATCAC-3'。β-actin Forward primer：5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3'，Reverse primer：5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3'。采用SYBR Green 荧光染料在Eppendoff 高通量荧光定量PCR 仪中进行。每份标本设3 个平行对照反应孔，反应条件：50℃2 min，95℃10 min，95℃20 s，60℃30 s，70℃30 s，共40 个循环，反应结束后自动分析荧光信号并转换为起始拷贝数及循环阈值(Ct)。以2-△△Ct值为mRNA 相对表达量。(2)免疫组织化学：将结肠癌组织芯片(4 μm)分别于二甲苯中脱蜡，梯度乙醇中水化。柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中行高压抗原热修复，3%H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min。PBS洗5 min×3 次后，滴加用一抗：(Anti-HOXA1 antibody，1∶200)50 μL，4℃孵育过夜。室温复温后滴加EnVision™Detection Kit，Peroxidase/DAB，Rabbit/Mouse(鼠/兔通用型)二抗200 μL，室温孵育30 min。显微镜下DAB(二氨基联苯胺)显色，苏木素复染、盐酸乙醇化、脱水并中性树胶封片。用已知结肠癌切片作为阳性对照，PBS代替一抗为阴性对照。结果判读：细胞内出现棕黄色颗粒者为阳性。根据染色的范围和强度之和进行评分：染色范围：0分，0%；1分，1%～25%；2分，26%～50%；3分，＞50%。染色强度：0分，未染色；1分，淡黄色；2分，棕黄色；3分，棕褐色。最终结果：0～2分，阴性；3～4分，弱阳性；5～6分，强阳性[7]。

1.3 统计学方法 应用SPSS25.0 统计软件分析所有数据。计量资料以均数±标准差()表示，计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA 质量控制 所有样本的RNA 在A260/A280的比值均在1.8～2.0，结果显示所提取的RNA无蛋白质污染，无降解，可用于RT-qPCR检测。

2.2 66 对结肠癌新鲜冰冻样本HOXA1 mRNA的表达水平 RT-qPCR检测结果显示，结肠癌组织中HOXA1 mRNA 的相对表达量为5.634±0.563，明显高于正常结肠组织的1.893±0.442，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)，见图1。

图1 RT-qPCR检测66对样本HOXA1 mRNA的表达水平Figure 1 RT-qPCR analysis of HOXA1 mRNA expression in 66 paired specimens of colon cancer tissues and normal tissues

2.3 结肠癌及配对正常组织中HOXA1蛋白的表达水平比较 203例结肠癌组织芯片进行免疫组织化学检测，结果显示，HOXA1 蛋白主要表达于细胞核中，其在结肠癌组织中的表达阳性率高于正常结肠组织，差异有显著统计学意义(P＜0.01)，见表1和图2。

图2 结肠癌及配对正常组织中HOXA1蛋白的表达水平(DAB染色×10)Figure 2 Expression of HOXA1 protein in colon cancer tissue and corresponding normal tissues(DAB staining×10)

表1 结肠癌及配对正常组织中HOXA1蛋白的表达水平比较[例(%)]Table 1 Comparison of HOXA1 expression level in human colon cancer tissue and corresponding normal tissue[n(%)]

2.4 HOXA1 表达与结肠癌临床病理特征的关系 结肠癌组织中，HOXA1 的表达水平与患者年龄、性别及肿瘤位置无显著相关性(P＞0.05)；HOXA1 表达水平与AJCC 分期、肿瘤浸润深度(T 分期)、淋巴结转移、远处转移及组织学分型相关(P＜0.05)，见表2。HOXA1 表达越强，患者AJCC 分期越晚，具备组织学分型差的高危因素。

表2 203例结肠癌中HOXA1表达与临床病理特征的关系(例)Table 2 The relationship between HOXA1 expression and clinicopathological characteristics in 203 cases of colon cancer(n)

3 讨论

结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤，其发生发展是由遗传物质改变和外部环境相互综合作用长期演变的结果。目前针对结肠癌的发生发展机制尚未完全阐明，但与之相关的新型分子生物标志物筛选为其提供了新的治疗方向[8]。同源异形盒基因A1(HOXA1)作为转录调控基因参与了肿瘤细胞恶性生物学行为相关基因的转录调控。血管新生是恶性肿瘤重要的生物学特征，HOX基因家族成员在血管新生中具备正向调控及反向调控的作用。例如：HOXA3 可通过上调ICAM1、MMP14 等基因的表达促进血管新生，而HOXA5、HOXB13 则通过下调VEGFR2、HIF1α、ephrin A1等血管生成基因的表达发挥抑制血管新生的作用[9]。文献报道HOXA1的异常高表达可以促进肺癌、黑色素瘤、胰腺癌等恶性肿瘤的发生发展[10-11]。HOXA1 广泛存在于乳腺上皮细胞，其异常高表达能够促进乳腺上皮细胞间质转化，进而调控Wnt/β-catenin信号通路促进乳腺癌的发生发展[12-14]。在乳腺癌中，RBCK1/HOIL-1 以及TRAF2 是HOXA1 的下游特异性靶点。HOXA1通过与TRAF2启动子序列结合直接激活TRAF2，进而活化IκB激酶(IKK)并磷酸化降解IκBα，激活NF-κB信号通路，最终导致肿瘤细胞增殖活性增加、凋亡减少等恶性生物学行为改变[15-16]。

本研究应用结肠癌新鲜冰冻样本检测HOXA1 mRNA 的表达情况，结果显示HOXA1 在结肠癌组织中的mRNA表达水平显著高于正常结肠组织。203例结肠癌石蜡样本中进一步免疫组化结果显示，62.56%的结肠癌组织中高表达HOXA1，显著高于对照组，此结果与转录水平检测结果一致。结肠癌中HOXA1的高表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移及组织学分型相关，而与年龄，性别及肿瘤位置无显著相关。HOXA1 高表达的患者淋巴结转移率为85.71%，而阴性表达的患者淋巴结转移率仅为14.28%。HOXA1 在Ⅲ～Ⅳ期结肠癌患者中的高表达比例显著高于Ⅰ～Ⅱ期结肠癌的患者(82.65%vs 43.81%)。上述结果提示高表达HOXA1的结肠癌患者具备预后不良的高危因素。

综上所述，HOXA1 异常高表达在结肠癌进展过程中起到重要的作用，HOXA1 异常高表达的结肠癌患者淋巴结转移率高，临床分期晚，提示此类患者预后不良，HOXA1 可能为判断结肠癌预后的新型分子标志物。但是HOXA1促进结肠癌发生发展的分子生物学机制尚未明确，需要进一步研究探讨。