热打击对人脐静脉内皮细胞黏附分子表达的影响

何旋，陈文达，潘志国

解放军南部战区总医院重症医学科/解放军热区损伤与组织修复重点实验室，广东 广州 510010

重症中暑是机体暴露于高环境温度或剧烈运动后，机体核心体温超过40℃以中枢神经系统损害为主要特征的急性热损伤相关疾病，常可伴随全身炎症反应综合征，患者病情进一步加重将继发多脏器功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)甚至危及患者生命[1-2]。目前大量研究表明，在重症中暑的病理生理过程中，涉及内皮细胞、肠上皮细胞的损伤以及凝血系统的失衡[3]；大量炎症因子的释放通过炎凝通路互相作用进而引发MODS，其中血管内皮细胞(vascular endothelial cells，VECs)是中暑发病过程中损伤最早的细胞，其损伤被认为是重症中暑病理生理进展的关键环节[4-5]。但目前重症中暑导致VECs损伤并继发炎症反应的具体机制仍不明确。P-选择素、E-选择素及细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)均属于细胞黏附因子选择素家族，当血管内皮细胞受到各种理化因素刺激时，上述黏附因子选择素家族表达量增加[6]，从而介导白细胞和血小板的黏附和聚集，进而诱导机体产生一系列炎症反应过程，加重病情发展。本研究旨在观察热打击对人脐静脉内皮细胞内(HUVEC)重要黏附因子P-选择素、E-选择素及ICAM-1 表达的影响，以探讨热打击后血管内皮细胞参与的部分机制。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料与试剂 P-selectin 购买自SANTA CRUZ，货号sc-6943)；E-selectin 及ICAM-1均购买自Abcam，货号分别为ab185698 及ab53013)；Anti-mouse IgG HRP-linked Antibody、Anti-rabbit IgG HRP-linked Antibody 及GAPDH 均购买于北京瑞康生物。

1.2 细胞培养 人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)为南方医科大学病理生理学实验室赠送。HUVEC细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM 培养液中。将HUVEC 细胞置于细胞培养箱中培养，次日根据细胞生长情况换液。每隔2～3 d进行1次传代(传代比例为1∶2～1∶5)。

1.3 细胞分组与热打击 对照组将细胞始终置于正常细胞培养箱中培养；热打击温度梯度组分别置于不同温度梯度(40℃、41℃、42℃、43℃)细胞培养箱打击2 h，43℃热打击不同复温组于43℃细胞培养箱中打击2 h，然后置于正常细胞培养箱中培养(按不同复温时间点复温0 h、3 h、6 h、12 h)。

1.4 Western blot 检测P-选择素、E-选择素及ICAM-1的表达 按照上述分组处理细胞。用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞3 次，每个6 cm 的培养皿加入50 μL RIPA裂解液在冰上裂解20 min。收集细胞裂解液低温高速离心(4℃，12 000 r/min，离心15 min)，收集上清于新EP 管。用BCA 蛋白定量/浓度测定试剂盒测蛋白浓度。每个泳道30 μg 蛋白总量进行Western blot 检测。Western blot 检测P-选择素、E-选择素及ICAM-1的表达。

1.5 免疫荧光观察HUVEC 细胞P-选择素及E-选择素表达 将传代后的细胞置于激光共聚焦小皿。热打击温度梯度组为分别置于不同温度梯度(40℃、41℃、42℃、43℃)细胞培养箱打击2 h，43℃热打击不同复温组于43℃细胞培养箱中打击2 h，然后置于正常细胞培养箱中培养(按不同复温时间点复温0 h、3 h、6 h、12 h)。复温结束后将皿中培养液移除，PBS 清洗后分别加入4%多聚甲醛固定及使用0.2%Triton X-100 通透，依次加入荧光一抗、二抗及DAPI在激光共聚焦显微镜下观察。

1.6 统计学方法 所有数据均采用Prism 6.0 软件(GraphPad Software,Inc.,La Jolla,CA)进行统计学分析。计量资料符合正态分布，以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 温度梯度热打击对HUVEC 细胞P-选择素表达的影响 分别用温度为40℃、41℃、42℃及43℃热打击HUVEC 细胞2 h，结果显示，内皮细胞在正常情况下可表达一定量P-选择素，不同温度梯度热打击HUVEC细胞后P-选择素的表达水平比较差异无统计学意义(F=0.859 7，P=0.510 1＞0.05)，见图1。

图1 不同温度热打击对HUVEC细胞P-选择素表达的影响Figure 1 Effect of heat stress at different temperatures on the expression of P-selectin in HUVEC cells

2.2 43℃热打击后不同复温时间点HUVEC细胞P-选择素表达的变化 为了进一步观察不同复温时间点HUVEC细胞P-选择素表达水平的变化，用43℃热打击HUVEC细胞2 h，随后置于37℃孵箱中继续培养至不同时间点(0 h、3 h、6 h、12 h)。结果显示，与对照组相比，43℃热打击2 h后不同复温时间点，HUVEC细胞P-选择素表达水平比较差异无统计学意义(F=0.282 1，P=0.885 0＞0.05)，见图2、图3。

图2 43℃热打击2 h后不同复温时间点HUVEC细胞P-选择素的表达Figure 2 The expression of P-selectin at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

图3 共聚焦检测43℃热打击组不同复温时间点HUVEC细胞P-选择素的表达Figure 3 The immunofluorescence of P-selectin at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

2.3 热打击对HUVEC细胞E-选择素的影响 上述实验结果表明，无论是不同温度热打击，抑或是43℃热打击不同复温时间点均对HUVEC 细胞P-选择素表达无影响，为了进一步观察热打击对HUVEC 细胞E-选择素表达的影响，用43℃热打击HUVEC 细胞2 h，随后置于37℃孵箱中继续培养至不同时间点(0 h、3 h、6 h、12 h)，结合WB及免疫荧光图可见，在不受外界刺激情况下，HUVEC仅表达少量E-选择素，并且主要表达于内皮细胞表面，热打击可使HUVEC 细胞表面E-选择素表达明显增加，且随着复温时间延长而增加，在复温6 h时达最高，差异有统计学意义(F=20.23，P＜0.05)，见图4、图5。而后随着复温时间延长而降低，在复温12 h降至基底水平。

图4 43℃热打击2 h后不同复温时间点HUVEC细胞E-选择素的表达Figure 4 The expression of E-selectin at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

图5 共聚焦检测43℃热打击不同复温时间点HUVEC细胞E-选择素表达的变化Figure 5 The immunofluorescence of E-selectin at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

2.4 热打击对HUVEC 细胞ICAM-1 表达的影响 进一步观察热打击对HUVEC 细胞黏附因子选择素家族另一成员ICAM-1 表达的影响，用43℃热打击HUVEC细胞2 h，随后置于37℃孵箱中继续培养至不同时间点(0 h、3 h、6 h、12 h)。结果显示，热打击可使HUVEC 细胞ICAM-1 表达随复温时间延长而增加，在复温6 h 时达最高，同样至复温12 h降至正常水平，趋势与E-选择素基本一致，差异有统计学意义(F=16.93，P＜0.05)，见图6。

图6 43℃热打击组不同复温时间点HUVEC细胞ICAM-1的表达Figure 6 The expression of ICAM-1 at different rewarming time points after 2 hours of heat stress at 43℃

3 讨论

重症中暑是以高热和中枢神经系统损伤为主要表现的急性热损伤相关疾病。既往研究认为，重症中暑病理生理过程中，其重要脏器损害主要来源于热暴露的直接细胞毒性作用[7-8]。目前越来越多证据表明，重症中暑引起脏器功能损害的病理生理学过程是一种继发于热损伤之后，炎症和应激作用下机体炎性反应呈“瀑布样”引发全身炎症反应综合征，继而引起弥漫性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)及MODS9。血管内皮细胞在大量细胞因子作用下可释放多种细胞因子及黏附分子，进而表现为“类脓毒症”反应，引发凝血反应产生凝血功能紊乱甚至DIC，凝血反应进一步加剧炎症反应，产生更多炎症因子，加重组织细胞损伤和器官功能障碍，并最终导致MODS[10-11]。因此，血管内皮损伤继发的凝血功能紊乱和MODS被认为是重症中暑的关键性环节[12]。

细胞黏附分子包括经典的免疫球蛋白超家族(ICAM-1、VCAM-1)、选择素家族(P-、E-、L-选择素)、整合素分子和非经典如VAP-1 和CD44 等分子，通过介导炎症细胞与组织或内皮细胞黏附参与炎症与免疫应答反应，并在出凝血过程、创伤后伤口愈合、肿瘤细胞的浸润与转移等多种病理生理过程中发挥着重要的生物学功能[13]。为此，本实验在体外模拟HUVEC热应激的过程，观察热打击HUVEC细胞后P-选择素、E-选择素及ICAM-1 表达的影响，由此分析重症中暑发病过程中血管内皮细胞参与的部分机制。

目前大量研究表明P-选择素在机体内能以膜蛋白和可溶性蛋白分别储存在血小板和内皮细胞、血液循环中，在血小板及内皮细胞被激活后，P-选择素在几分钟内易位到细胞表面上[14-15]。本研究发现，使用不同温度梯度热打击2 h及43℃热打击2 h不同复温时间点，WB检测HUVEC细胞P-选择素的表达水平及免疫荧光观察HUVEC细胞表面P-选择素的表达均无明显差异，该结果与既往文献中研究结果存在差异，可能与P-选择素表达方式有关。P-选择素在正常内皮细胞主要储存于Weibel-Palade 小体，刺激后快速移位于内皮细胞表面，其最大表达量为刺激后5～10 min，30～60 min内P-选择素从细胞表面清除。本研究的热打击时间为2 h，推测热打击早期过程中即有P-选择素表达改变，而随打击时间及复温时间延长P-选择素已从细胞表面清除并脱落致细胞上清中，故实验结果中未能观察到P-选择素有表达差异，如有条件可进一步使用酶联免疫吸附试验检测细胞上清中P-选择素浓度，从而进一步验证热打击对HUVEC细胞P-选择素表达影响。

E-选择素在正常内皮细胞基本不表达，在炎症因子、肿瘤坏死因子TNF-α等的刺激下活化并表达于内皮细胞外膜[16]，介导白细胞滚动并粘附于内皮细胞。有研究发现，在T细胞介导的免疫反应中，T细胞主要通过其表面的黏附分子整合素家族与血管内皮细胞表面选择素家族经过配体与受体相结合，参与T 细胞发生滚动、停滞进而迁移，通过内皮细胞进入细胞间质，最终到达损伤部位[17]。亦有研究表明，E-选择素与全身炎症反应综合征的严重程度存在明显相关性，并可作为其判断严重程度和预后的相关指标[18]。另外有研究发现，使用中暑小鼠血清刺激血管内皮细胞，VCAM-1 及ICAM-1 的表达显著上调，对单核细胞的黏附能力增加，表明内皮细胞表面的黏附分子参与了中暑白细胞与内皮细胞的黏附[19-20]。本研究中热打击使HUVEC 细胞E-选择素及ICAM-1 表达明显增加，在复温6 h 达峰值，随后12 h 后降到基底水平，这与既往研究结果相一致[21]：相对于P-选择素可储存模式，刺激后E-选择素的表达需要从头转录。因此，E-选择素在刺激3～4 h 后细胞表面可检测到，在16～24 h后下降到基础水平。

基于上述研究结果，我们推测热打击可能主要通过E-选择素及ICAM-1介导内皮细胞参与炎症反应，在中暑的“类脓毒症”反应起到相关重要的作用，而P-选择素在其中的作用仍不明确，下一步研究中将进一步完善相关检测方法，从而明确P-选择素在热打击中的表达改变及可能作用机制。本研究将有助于了解重症中暑内皮损伤及炎症反应之间的相互关系，为中暑“类脓毒症反应”提供研究依据。