QuEChERS-UPLC-MS/MS法快速测定水产品中氯霉素

常 波

（营口市农业农村综合发展服务中心（营口市农产品质量安全检验监测中心），辽宁营口 115004）

氯霉素类（Chloramphenicol，CAP）是一种人工合成的广谱抗生素，价格便宜、抑菌性强、体内吸收良好，被广泛应用于水产动物的疾病防控[1]。这些药物一般较稳定，不易降解，在水产品中残留可通过食物链进入人体，氯霉素能引起人的再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、新生儿灰色综合征等疾病，尤其是氯霉素的低浓度药物残留会诱发致病菌的耐药性[2]。氯霉素的残留不但对人体造成危害，还会严重影响我国动物性食品的出口。我国在水产品养殖过程中禁止添加或使用氯霉素，2019年农业农村部发布了动物食品中禁止使用的药品及其他化合物清单，规定在动物食品中不得检出氯霉素[3]。

目前的标准前处理方法需要反复提取和氮吹浓缩吹干，前处理时间长，难以满足批量水产品中氯霉素残留量的快速筛查。QuEChERS是由美国化学家Lehotay和德国的Anastassiadas于2003年提出的一种快速（Quick）、简便（Easy）、便宜（Cheap）、有效（Effectiv）、可靠（Rugged）及安全（Safe）的样品处理技术[4-6]，最早在农药多残留中使用。因此本方法采用Simle-QuEchERS Nano-Ant快速测定水产品中的氯霉素残留量。这样操作既简单快速，又能保证检测的准确性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲤鱼，购买于营口市某农贸市场；氯霉素（CAP，99.8%）、氯霉素氘代物（CAP-D5，100 μg·mL-1），购自MedJen；甲醇、乙腈（色谱纯，德国Meker公司）；QuEChERS-SPE抗生素净化小柱含盐包 4.0 g无水硫酸镁（MgSO4），1.0 g氯化钠，陶瓷均质子（LUMTECH）；试验用水均为超纯水。

Aglient超高效液相色谱-质谱三重四极杆联用仪6460（配有EI离子源）；分析天平（感量0.01 g、0.00 001 g，瑞士Mettle Toledo公司）；涡旋振荡器（德国Heidolph）；1 000 μL移液枪（德国艾本德）；冷冻离心机（美国Thermo Fisher Scientifi）；全自动氮吹浓缩仪N1（上海屹尧Preekem）；Milli-Q Advamtage超纯水器（美国Millipore）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品前处理

称取匀浆样品5.0 g（准确至±0.02 g），加CAP-D5内标工作液250 μL，于50 mL具塞离心管中；加入 4.0 mL超纯水和10 mL乙腈，涡旋5 min，加入4.0 g无水硫酸镁（MgSO4），1.0 g氯化钠（NaCl）及一颗陶瓷均质子，涡旋1 min；4 ℃下离心，10 000 r·min-1， 5 min；取一支Simle-QuEchERS Nano-Ant抗生素净化柱垂直塞入50 mL具塞离心管中，缓慢下压净化柱顶部，上层清液随压力，自下而上进入净化柱储液槽内；使用移液枪至净化柱储液槽内，吸取2 mL上清液于 40 ℃水浴中氮气吹至近干，1 mL流动相定容；过0.22 μm有机微孔滤膜至进样瓶，LC-MS/MS待测定。

1.2.2 标准曲线制备

用乙腈将氯霉素配制成10 ng·mL-1、50 ng·mL-1的标准中间液和将氘代氯霉素配制成20 ng·mL-1的标准中间作液。分别精确量取10 ng·mL-1标准液0.050 mL、0.100 mL和50 ng·mL-1标 准 液0.040 mL、0.100 mL、 0.200 mL，再分别加入0.250 mL浓度为20 ng·mL-1的氘代氯霉素内标溶液，用20%的乙腈溶液稀释成氯霉素浓度为0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和 10.0 ng·mL-1、内标CAP-D5浓度为5.0 ng·mL-1的标准溶液，供液相色谱法-串联质谱法测定。以测得特征离子质量色谱峰外标和内标峰面积比为纵坐标、对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。

1.2.3 仪器条件

（1）色 谱 条 件。色 谱 柱：Agilent Poroshell 120 EC-C18柱（100 mm×3.0 mm，2.7 μm）；柱温： 30 ℃；进样量：20 μL；流速：0.35 mL·min-1；流动相为乙腈-水进行梯度洗脱见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序表

（2）质谱MS条件。负离子电喷雾ESI-多反应监测（MRM）模式；扫描方式：负离子；毛细管电压：4 000 V；雾化气压力（GSI）：40 psi；气流温度：350 ℃；鞘气流速：9 L·min-1。氯霉素的MRM模式定性定量分析参数见表2。

表2 氯霉素MRM模式定性定量分析参数表

2 结果与分析

2.1 样品前处理优化

本方法考察了水产品前处理中加入甲醇、乙腈对氯霉素类药物的提取率的影响[7]，乙腈可避免提取脂肪，同时又能沉淀蛋白质，可提高氯霉素提取率，因此本方法采用加入超纯水和乙腈进行提取，再加入盐包（4.0 g无水硫酸镁，1.0 g氯化钠）进行盐析除蛋白和脱水，脱水会减少氮吹时间，提升检测效率，用Simle-QuEchERS Nano-Ant抗生素净化柱进行净化，代替正己烷除脂和通常用的SPE小柱净化，此QuEchERS小柱操作步骤快速简单，免去繁杂的提取步骤，节省前处理时间。

2.2 工作曲线线性范围

以氯霉素浓度为横坐标，以氯霉素峰面积与CAP-D5峰面积比值为纵坐标，得到其线性方程为y=0.988 640x-0.017 632（R2=0.999），氯霉素在0.5～ 10 ng·mL-1时，线性关系良好。空白鲤鱼肉中添加 1.0 μg·kg-1氯霉素和CAP-D5MRM色谱图见图1。

图1 空白鲤鱼肉中添加1.0 μg·kg-1氯霉素和CAP-D5的MRM色谱图

2.3 方法回收率和精密度

在5.0 g空白鲤鱼肉中添加3个低、中、高的浓度水平标准溶液，添加浓度分别为10 ng·mL-1氯霉素标准溶液0.1 mL，50 ng·mL-1氯霉素标准溶液 0.1 mL，0.5 μg·mL-1氯霉素标准溶液0.1 mL，20 ng·mL-1CAP-D5标准中间液250 μL，添加浓度水平分别为 0.2 μg·kg-1、1.0 μg·kg-1、10.0 μg·kg-1，添加的CAP-D5浓度为5.0 ng·mL-1，每个添加水平做6个平行，按照1.2.1前处理的方法进行处理，测定氯霉素峰响应值的相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD），计算方法的回收率和精密度。由表3知，3个添加水平的平均回收率为100%～115%，精密度为3.6%～10.0%，满足测定要求。

表3 方法回收率和精密度RSD结果表（n=6）

3 结论

对氯霉素的标准方法进行优化，用水和乙腈进行提取，Simle-QuEchERS Nano-Ant抗生素净化柱进行净化，代替标准中乙腈和乙酸乙酯反复提取和正己烷除脂，减少前处理的时间，提升检测效率。并加入CAP-D5作为内标进行检测，一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。此QuEChERS方法操作简单、灵敏度高、结果准确，并且回收率和精密度满足测定要求，适合大批量水产品中氯霉素的残留量筛查。