口腔黏膜下纤维性变癌变的分子机制研究进展

李冰霞，温琦涛，王 涛，孙冠宇，符 骁，苏守达

（1.海南医学院口腔医学院，海南 海口 571199；2.海南省人民医院口腔科，海南 海口 570311）

口腔黏膜下纤维性变（oral submucous fibrosis，OSF）是一种因过多的细胞外基质沉积而导致口腔黏膜上皮萎缩、口腔黏膜下固有层胶原堆积和血管减少的炎症性反应，早期病理表现为胶原纤维水肿、血管扩张充血，可见上皮下疱和过度角化，晚期致密的纤维替代深层肌组织，胶原纤维玻璃样变，血管和成纤维细胞明显减少，有轻至中等程度慢性炎症细胞浸润，部分病例见上皮异常增生。OSF 可出现7%～13%几率的癌变，且随着社会经济的发展及槟榔商品化，这一概率将随之增加［1，2］。一些流行病学及病例对照研究表明该病具有明显的地域性特征，国外的东南亚地区及中国的海南、湖南和台湾等地具有较高的患病率，这些地区居民有咀嚼槟 榔 的 习 俗，是 导 致OSF 癌 变 的 主 要 因 素［3，4］。本文系统整理了国内外近年来关于OSF 癌变的研究报道，围绕细胞周期改变、遗传易感性、表观遗传调控、上皮-间充质转化、缺氧与血管生成等方面对OSF 癌变的分子机制进行综述。

1 细胞周期改变

细胞周期是一个准确而有序的过程，该过程受到多种基因和蛋白调控，当这些基因和蛋白表达异常时，会出现细胞增殖失控、细胞凋亡抑制，遗传不稳定因素积累的现象，进而导致肿瘤的发生。因此，细胞周期的改变可能是OSF 癌变的机制之一。

p21 和p27 是肿瘤抑制因子，也是细胞周期检查点的重要调节因子，在基因组完整性方面发挥着重要作用。体外研究发现，槟榔碱可增强OSCC 细胞中的活性氧（ROS），通过ROS/mTORC1 途径下调OSCC 细胞中p21 和p27 的表达，促进细胞周期G1/S 期转变，增加了DNA 复制出错的概率，从而提高了OSF 癌变风险。

磷酸化激酶细胞分裂周期蛋白2（p34cdc2）与细胞周期蛋白B1（Cyclin B1）形成的唯一复合物p34cdc2-Cyclin B1 是细胞周期G2/M 期的关键调节因 子。Vay 等［5］发 现，p34cdc2- Cyclin B1 在 正 常、OSF 和OSF 癌变口腔黏膜组织中的表达逐渐增加，其表达增加可磷酸化凋亡抑制因子Survivin。另有研究指 出，磷 酸 化Survivin（phosphorylation-Survivin，p-Survivin）的表达水平在OSF 癌变为OSCC 组中明显高于正常组和OSF 组，在OSF 的癌变过程中表达呈上升趋势［6］，提示p-Survivin 可能通过抑制细胞凋亡，促进了细胞分裂和增殖，严重影响了有丝分裂期的稳定，导致了OSF 的癌变。

增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表达与细胞分裂密切相关，在G1、S期增加，G2 期减少。PCNA 在OSF 和口腔鳞状细胞癌（OSCC）中均有表达，在OSF 中主要在上皮基底层、棘层表达，在OSCC 中可在上皮全层表达［7］。随着口腔组织从正常上皮到OSF 再到OSCC，PCNA 的分布逐渐增加，证实了细胞周期改变与OSF癌变相关。

2 遗传易感性

遗传易感性主要包括基因突变、单核苷酸多态性及基因的杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH）等。

槟榔中的生物碱、多酚及其特有的亚硝胺具有遗传毒性及致突变性，可直接作用于口腔黏膜并诱导OSF 的发生，进而癌变。Ekanayaka 等［8］观察到，槟榔碱在Ames 试验中具有突变性，可在几种类型的细胞中诱导姐妹染色单体交换、染色体畸变和微核形成。

基因启动子区域的SNP 与咀嚼槟榔导致的OSF 和OSCC 患者的易感性相关。研究发现，在OSF 和OSCC 中均有较高的胶原、基质金属蛋白酶、转 化 生 长 因 子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）以及赖氨酰氧化酶高危等位基因和基因型频率，其改变了转录活性和相应蛋白表达与功能，增加了OSF 癌变的危险性［9］。

Ray 等［10］研究发现，OSCC 标本中所有常染色体上均存在LOH 的现象，高频LOH 与OSCC 的进展和复发呈正相关；同时，OSF 和OSCC 共有的LOH 基因座含有多种参与维持口腔上皮遗传完整性和防御能力的抑癌基因，例如PTEN、乳腺癌基因1、2（BRAC1、BRAC2）、脆性组氨酸三联体（FHIT）以及细胞素色P450（CYP450）等，这些抑癌基因一旦发生LOH，其具有的DNA 修复、细胞黏附等功能将受到影响，使OSF 发生癌变。由此推测，LOH 可能在OSF 的癌变进展中起重要作用，并促进OSF的癌变。

3 表观遗传调控

表观遗传学改变指基因DNA 序列不变而功能发生可遗传的变化，导致表型变化，包括DNA 修饰、组蛋白修饰和非编码RNA 调控等。因其具有可遗传、可逆的特点，现已成为开发疾病生物标记物有吸引力的候选者，并成为治疗几种人类癌症的新兴靶点，也为了解OSF 癌变进程相关的分子和细胞事件提供了新的见解。

启动子异常甲基化是口腔癌最早的分子事件之一。Dickkopf-1（DKK1）是一种特异性抑制Wnt/β-catenin 通路的基因，在各种纤维化疾病和肿瘤中异常表达。DKK1 甲基化水平在正常组较低，在OSF 组和OSF 癌变组较高，提示DKK1 的高甲基化或许通过沉默DKK1 基因或通过抑制DKK1 基因的表达，异常激活Wnt/β-catenin 通路，导致OSF 的发生和癌变［11］。由此可见，发现检测原发肿瘤组织和体液中人类基因启动子CpG 岛甲基化是一种具有前景的非侵入性筛查和癌症早期诊断的方法，有望应用于口腔癌筛查中。

非编码RNA 的异常表达及功能障碍可促进OSF 的癌变。microRNA（miRNA）经常被发现位于与癌症风险相关的脆弱基因组位置和基因组区域，在癌症的发生和发展中有明确特征。miR-22 作为肿瘤抑制因子，其在槟榔碱处理的OSCC 细胞中表达受抑制，与c-Myc癌基因的表达上调相当，且c-Myc 也可直接抑制miR-22；另外，p53 是miR-22 的直接转录因子，可诱导miR-22 表达，但槟榔碱抑制p53 表 达，从 而 间 接 抑 制miR-22 表 达［12］，表 明miR-22 的异常表达在OSF 癌变过程中发挥了关键作用。长链非编码RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）的失控和功能障碍与多种恶性肿瘤相关。有研究通过对正常、OSF、OSCC 口腔黏膜组织进行RNA 测序，发现差异表达的lncRNAs 参与了炎症、Wnt 和p53 等信号通路，这些信号通路参与了OSF的炎症和纤维弹性病理变化以及进一步的癌变进展［13］。环状RNA（circRNA）是特殊的非编码RNA，Wang 等［14］学 者 对circRNA 进 行 微 阵 列 分 析，鉴 定了circEPSTI1 是一种circRNA，其在正常口腔黏膜到OSF 再到OSCC 具有一致地顺序上调，在功能上显著促进口腔鳞癌细胞的增殖和侵袭。

4 上皮-间充质转化

上皮-间充质转化（epithelial-mesen-chymal transition，EMT）使极化的上皮细胞向间充质表型转变，其特征是失去细胞-细胞连接，并获得纺锤形形态以建立运动型和侵袭性表型，在炎症、纤维化及肿瘤发生等过程中发挥关键作用。EMT 可促进细胞外基质的堆积，是OSF 及其癌变进程中的重要步骤。EMT 的特征包括上皮性标志物如E-钙粘蛋白（E-cadherin）、细胞角蛋白的表达和功能的丧失，及间质标志物的丰度增加，如N-钙粘蛋白（N-cadherin）、波形蛋白和整合素［15］。

咀嚼槟榔被认为是导致口腔EMT 并激活口腔颊黏膜成纤维细胞（buccal mucosal fibroblast，BMF）的主要病因，槟榔碱可降低BMF 中E-cadherin 的表达，增加N-cadherin 和波形蛋白的表达［16］。槟榔碱以剂量依赖的方式上调E-cadherin 转录抑制物Snail 的表达，继而触发了肌成纤维细胞的转分化，增加了多种纤维化因子，如Ⅰ型胶原（Col-1）和α-平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin，α-SMA）的表达，且增加了白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的表达，升高的炎性细胞因子导致口腔中组织修复和纤维化形成的失衡，且Snail 的过度表达与OSCC 的临床病理特征有关［17-19］。IL-6 通过信号转导和转录激活因子3（Stat3）/Snail 信号通路在多种癌症中诱导EMT［20］。有实验显示，IL-6 是Snail 的直接靶标，介导了Snail 诱导的肌成纤维细胞的激活，表明Snail 与IL-6 之间存在正向调节槟榔相关肌成纤维细胞转分化的环路，提示阻断Snail 可作为治疗OSF 的有力策略［21］。由此可推断，Snail对维持肌成纤维细胞的活性至关重要，以Snail 为靶点的治疗方法或许可以缓解OSF 的癌变，并下调由其引起的慢性炎症。除此之外，槟榔碱可上调胰岛素样生长因子-1 受体（insulin-like growth factor-1 receptor，IGF-1R）的转录，并诱导IGF-1R 磷酸化，从而诱导E-cadherin 转录抑制物锌指E 蛋白ZEB1 的激 活，降 低E-cadherin 的 表 达［22］，同 时 也 加 深 了 对EMT 在OSF 癌变进程中的理解。

整合素αvβ6 参与多种器官的病理性纤维化，其在OSF 中表达上调，证实了槟榔碱依赖αvβ6 的上调促进了口腔成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化［22］。OSF 癌变患者中RAS 基因表达率较高，这可能是OSF 癌变为OSCC 的原因之一。也有学者指出，槟榔碱可上调角质形成细胞αvβ6 的表达，继而 激 活TGF-β1，TGF-β1 和RAS 可 能 参 与 调 节 肿瘤细胞侵袭的EMT 过程［19］。

近年来有报道miRNAs 在槟榔碱诱导的EMT过程中的作用。miR-203 在OSF 组织中的表达明显低于正常口腔黏膜组织，其上调后显著抑制细胞增殖，显著上调了细胞角蛋白19（CK19）和E-cadherin 的表达，下调了N-cadherin 和波形蛋白的表达，从而逆转了EMT 进程［23］。另有研究者观察到槟榔碱可剂量依赖性地降低人骨髓间充质干细胞miR-200b 基因的表达，在骨髓间充质干细胞中过表达miR-200b 后，槟榔碱诱导的肌成纤维细胞活性被取消。此外，miR-200b 的增加抑制了α-SMA 的表达［24］。

这些研究表明槟榔导致口腔EMT 发生或许是OSF 癌变进程中的关键一环，亦可成为阻止OSF 癌变的潜在靶标。

5 缺氧与血管生成

缺氧诱导因子1α（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF-1α）被认为与上皮癌变有关［25］。HIF-1α 的稳定可促进肿瘤发生、血管生成的基因表达，并获得更具糖酵解的表型，使癌细胞不依赖氧气来产生ATP，新生血管和糖酵解的增加代表了对缺氧微环境的适应，这与肿瘤的侵袭和转移有关［26，27］。

HIF-1α 在成纤维细胞、上皮细胞和炎症细胞中的表达在正常、OSF、OSCC 组织中依次递增［28］。另外，OSF 组织中HIF-1α 在蛋白和基因水平均有上调，且与上皮异型增生相关，同时BMF 中槟榔碱可剂 量 依 赖 性 地 上 调HIF-1α 基 因 的 表 达［29，30］。这 表明细胞的增殖、成熟和代谢适应发生变化，增加了癌变的可能性。碳酸酐酶Ⅸ（carbonic anhydrase，CAⅨ）是一种缺氧诱导酶，已被证明是HIF 的直接靶标，负责调控细胞内pH 及参与细胞外空间的形成，在癌症中缺氧时显著上调，促进肿瘤细胞的侵袭［26］。有学者发现， OSF 中，CA 总活性和CAⅨ基因表达水平均高于正常BMF，且槟榔碱以剂量依赖性地增加正常BMF 中CAⅨ的表达，咀嚼槟榔的患者比不咀嚼槟榔的患者血浆CAⅨ水平更高，口腔癌患者的血浆CAⅨ水平在统计学上和临床分期显著相关［31］。

在几种人类癌症的癌前阶段，血管生成开关可能被激活，因此，肿瘤血管生成并不一定是浸润性肿瘤的特征，而可能是癌症发展过程中的早期事件。HIF-1α 的多种靶基因，如血管内皮生长因子、血管生成素和成纤维细胞生长因子，通过促进内皮细胞的有丝分裂和迁移活性来调节血管生成，促进不规则血管内皮细胞的增殖和分化［32］。从OSF 到OSCC 再到OSCC 伴OSF，HIF-1α 的表达呈上升趋势，且与血管密度呈正相关［33］。有体内研究显示，OSF 微血管变化以萎缩、减少为主，OSF 后期血管增加考虑为OSF 癌变［34］。由此推断，HIF-1α 的上调是OSF 癌变发生的早期事件。OSCC 组织中HIF-1α 的表达伴随着血管数目的增加，但与血管数量增加相比，成纤维细胞的数量增加更多，即OSF癌变是由于成纤维细胞引发的纤维化增加，更加缺氧的条件导致HIF-1α 的表达增加［25］。

由此可见，缺氧对OSF 癌变进展的影响是通过缺氧诱导的一系列蛋白质和基因组变化来介导的，这些变化激活了血管生成、无氧代谢和其他使肿瘤细胞能够生存或逃离缺氧环境的过程。

6 其他

除了以上所述机制，近些年学者们还从细胞衰老、肿瘤干细胞、微量元素、口腔微生物组、免疫微环境等多方面对OSF 癌变的分子机制进行了研究，同时对OSF 癌变的生物标志物及治疗靶标进行了新的探索，这些研究与探索将帮助人们对OSF 癌变的分子机制进行深层次的认识与理解，并对其癌变防治提供新的策略。

结语 OSF 癌变是一个复杂动态的过程，该过程主要涉及细胞周期变化、遗传易感性、表观遗传调控、上皮-间充质转化、缺氧与血管生成等多种分子机制。从OSF 的发生、发展到OSF 癌变为OSCC，各个机制之间相互影响，协同促进OSF 癌变的进展，因此进一步阐明槟榔诱发OSF 癌变的分子机制对今后槟榔咀嚼相关疾病的防治具有重要意义。随着OSF 及其癌变所产生的经济、社会等负担逐渐加重，临床医生与相关研究人员应当加强一级预防，对有槟榔咀嚼习惯的患者进行健康宣教。此外，早发现、早诊断、早治疗OSF 是预防OSF 癌变的关键。应当继续深入研究OSF 癌变的分子机制，确定主要的分子靶向方式，明确OSF 发生及癌变规律，为OSF 癌变的防治提供新的思路。

作者贡献度说明：

李冰霞：提出研究思路，撰写论文并修改；王涛、温琦涛：检查全文并提出修改意见，提供指导；孙冠宇、符骁、苏守达：协助收集文献，整理文档。

所有作者声明不存在利益冲突关系。