基于生物信息学分析SPHK1 在胃癌中的表达及临床价值

2023-12-23 04:32:42凌潜龙管佳佳朱爽秋
海南医学院学报 2023年23期
关键词:染色胃癌数据库

凌潜龙,管佳佳,纪 凯,朱爽秋,朱 冰

(1.蚌埠医学院第一附属医院胃肠外科,安徽 蚌埠 233000;2.蚌埠医学院第一附属医院肿瘤放疗科,安徽 蚌埠 233000)

胃癌(gastric cancer,GC)是常见的消化道恶性肿瘤之一,一直是南美、东欧和中国癌症相关死亡的重要原因[1-3]。虽然有些高发地区进行筛查,已经降低了胃癌相关死亡率和发病率,但总体5 年生存率仍然很低[4]。尽管腹腔镜手术和药物治疗取得了一系列进展,但晚期GC 患者仍然预后较差[5,6]。因此,为确定GC 发生进展的主要分子机理,寻找预后生物标志物和基因调控靶点将有助于进行个体化治疗。

鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1,SPHK1)作为体内一种脂质活性激酶,可将鞘氨醇磷酸化生成鞘氨醇-1-磷酸(S1P)[7,8],已被证明可以在癌症进展的不同阶段中的发挥各种功能[9,10]。SPHK1 通过上调癌细胞中的S1P 受体表达,参与疾病进程[11]。越来越多的研究发现SPHK1 在胃癌中起着至关重要的作用[12]。现在,许多研究表明 SPHK1 与胃癌诊断及预后生物标志物可能存在关联[13]。然而,SPHK1 在胃癌进展中作用和具体机制尚不清楚,本研究利用生物信息学分析预测SPHK1 在胃癌中的表达。通过分析SPHK1 在胃癌组织中与免疫细胞浸润的作用、与临床病理特征及预后的关系,以期为胃癌患者的诊断、治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验主要材料

临床样本收集于蚌埠医学院第一附属医院胃肠外科2020 年1 月~2022 年12 月手术切除的所需样本组织和临床病理数据。蛋白浓度BCA 试剂盒与凝胶PAGE 试剂盒均购自碧云天生物技术公司。Omni-ECLTM 显影试剂盒购自上海雅酶生物科技有限公司。小鼠多克隆抗体SPHK1、GAPDH 均购自武汉三鹰(Proteintech)公司。PVDF 膜购自Millipore 公司。其他试剂均为进口。

1.2 数据库分析

从HPA(https://www.proteinatlas.org)下载胃癌与癌旁组织数据。使用 TIMER2.0(http://timer.cistrome.org)数据库分析SPHK1mRNA 在不同恶性肿瘤中的表达水平情况。GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)数据库分析SPHK1 与肿瘤生长因子MKI67 在胃癌组织中的表达。Kaplan-Meier Plotter(http//:Kmplot.com)数 据 库 在 线 分 析SPHK1mRNA 的表达水平与胃癌患者生存预后的关 系。cBioPortal(https://www.cbioportal.org)数据库下载与SPHK1 在胃癌中共表达的潜在靶基因。DAVID(https://david.ncifcrf.gov)数据库分析下载富集相关数据。使用微生信网站(http://www.bioinformatics.com.cn)在线编辑处理下载数据。基于TISCH(http://tisch.comp-genomics.org/home)给定的数据,探讨SPHK1 与TME 之间的关联,其中网站提供的胃癌芯片为GSE134520。

1.3 免疫组织化学

50 例胃癌组织和34 例匹配的相邻正常组织按标准程序进行包埋。具体操作参考Deng 等[14]。由2 名病理科医师独立进行盲审评分。染色百分率评分:0(<5%阳性细胞);1 个(5%~24%阳性细胞);2 个(25%~49%阳性细胞);3 个(50%~74%)和4个(≥75%)。染色强度评分为:0(未染色)、1(弱)、2(中等)、3(强)。联合染色评分等同于染色百分比score×staining 强度评分,联合评分≥4 为阳性表达,联合评分<4 为阴性表达。

1.4 Western Blot

将胃癌与癌旁组织进行蛋白提取,使用BCA 法对获取的蛋白进行定量。取适量蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳,在电泳试验完毕后将蛋白凝胶转移至0.45 μm 的PVDF 薄膜上进行转膜。之后将膜浸入封闭液中封闭60 min。封闭完成3 次洗膜后,稀释相应一抗将 PVDF 薄膜放至4℃冰箱过夜孵育。次日洗膜,与二抗室温摇床孵育90 min 为宜。ECL-plus 检测 PVDF 膜上的蛋白信号,然后曝光并显影。

1.5 统计学处理

采用数据库默认的统计学方法。用Person 相关分析SPHK1 与相关基因表达的关系;采用Kaplan-Meier Plotter 统计患者生存率,并用Log-rank 检验方法分析SPHK1 的表达与患者生存预后的关系;用χ2检验分析SPHK1 的阳、阴性表达与患者临床病理特征的关系;胃癌与癌旁组织的WB 结果采用wilcoxon 检验。以双侧P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SPHK1 在细胞中的定位检测

基于HPA 数据库检索,SPHK1 可能在细胞模型中的胞质内表达,见图1A。为进一步定位,利用HPA 数据库分析细胞表达SPHK1 的免疫荧光,表明SPHK1 在人体正常细胞胞质中高表达,见图1B。

图1 SPHK1 在细胞中的定位检测Fig 1 Localization detection of SPHK1 in cells

2.2 SPHK1 在人体正常胃组织中的表达

HPA 数据库解析,表明SPHK1 广泛分布于身体各组织。在人体多种组织中SPHK1 低表达,且在人正常胃组织中表达也不高,见图2A。此外,SPHK1 在正常胃组织细胞中也广泛表达,如基质细胞、纤维细胞、T 细胞等,见图2B。

图2 SPHK1 在人体正常组织和细胞中的表达Fig 2 Expression of SPHK1 in normal human tissues and cells.

2.3 SPHK1 在不同肿瘤类型中的表达

TCGA 数据库数据显示,SPHK1 在多种癌症中呈现高表达趋势,如乳腺浸润癌(BRCA)、胆管癌(CHOL)、结肠癌(COAD)、肝细胞癌(LIHC)、肺腺癌(LUAD)等(P<0.05)。其中SPHK1 在胃癌组织中的表达水平远高于癌旁组织,P<0.001,差异有统计学意义,见图3A。同时,根据HPA 数据库下载胃癌组织与正常组织中SPHK1 表达的免疫组化染色结果,表明SPHK1 在胃癌组织中高表达,见图3B。

图3 SPHK1 在各种肿瘤组织中的表达情况Fig 3 Expression of SPHK1 in various tumor tissues

2.4 SPHK1 表达水平与患者预后的关系

为深入探究SPHK1 与胃癌患者预后的关联。首先,采用GEPIA 数据库分析SPHK1 与肿瘤生长因子MKI67 在胃癌组织中的表达[15]。结果显示,见图4A,SPHK1 在胃癌组织中的表达量高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。其次,见图4B,胃癌组织中MKI67 表达水平也高于癌旁组织,P<0.05,差异有统计学意义。此外两者表达呈正相关,差异有统计学意义(P=0.000 49),见图4C。可能提示SPHK1 高表达与胃癌患者不良预后有关。另外,利用Kaplan-Meier Plotter 数据库,在线评价SPHK1mRNA 的表达状况与胃癌患者生存预后的关系。结果表明,高表达的SPHK1 在胃癌中预示了较差的总生存期,log rankP=0.002,见图4D。同时,也预示了更差的进展后生成期,log rankP=0.001 9,见图4E,差异有统计学意义。

图4 SPHK1 表达水平与胃癌患者预后的关系Fig 4 Relationship between SPHK1 expression levels and prognosis of gastric cancer patients

2.5 胃癌中的基因通路富集

在本研究中,首先利用cBioportal 数据库下载与SPHK1 在胃癌中共表达的前500 个潜在靶基因,再利用DAVID 数据库分析下载与SPHK1mRNA富集相关数据。包括生物过程(biological process,BP)、细胞组成(cellular component,CC)、分子功能(molecular function,MF)和KEGG 通路。利用微生信网站对数据进行分析并得出结果。见图5A~C,发现在由BP、CC 和 MF 构成的GO 分析中,富集到包括细胞内受体(intracellular receptor)、ATP 酶激活(ATP enzymes activation)、生 长 结 合 因 子(growth binding factor)等癌症相关信号通路(P<0.05)。而在KEGG 富集通路中,SPHK1 潜在靶基因也富集了已被广泛研究并证实与胃癌发展有关的信息通路,如Hedgehog signaling pathway、Relaxin signaling pathway 和cAMP signaling pathway 等,见图5D,差异有统计学意义(P<0.05)。

2.6 SPHK1 对肿瘤微环境的影响

肿瘤微环境(tumour microenvironment,TME)非常复杂。TME 内的各种免疫基质细胞与癌细胞相互作用,调节肿瘤细胞增殖、侵袭等过程[16-18]。因此,深入研究SPHK1 与TME 关系十分必要。利用TIMER 数据库研究发现,在胃癌免疫微环境中,SPHK1mRNA 的表达水平与肿瘤纯度呈负相关(偏相关系数=-0.148),P<0.001。另一方面,SPHK1 在免疫微环境中与B 细胞也呈负相关(偏相关系数=-0.291)(P<0.001),存在统计学意义。此外,在免疫微环境中SPHK1 与中性粒细胞、树突状细胞呈正相关(偏相关系数均为正值),而与CD8+T 细胞、CD4+T 细胞和巨噬细胞的表达无确切关联(P>0.05),见图6A。基于TISCH 给定的数据,探讨SPHK1 与TME 之间的关联。网站提供的胃癌芯片为GSE134520,收录TME 相关细胞包括肿瘤细胞、免疫细胞( 如CD8+T 细胞、浆细胞等) 、间质细胞(如黏液细胞、成纤维细胞等),SPHK1基因与TME 相关性分析结果如下:SPHK1基因在肿瘤细胞中的表达量最高( Malignant cells:log(TPM/10+1) =0.39),见图6B。此外,在巨噬细胞中,低SPHK1 表达组胃癌患者的进展后生存期优于SPHK1 高表达组,log rank P=0.002,差异有统计学意义,见图6C。而在中性粒细胞、树突状细胞、CD8+T 细胞、CD4+T 细胞 和B细胞中,SPHKmRNA 低表达对胃癌患者生存期无显著差异(P>0.05)。

图6 SPHK1 对胃癌免疫微环境的影响Fig 6 Impact of SPHK1 on the immune microenvironment of gastric cancer

2.7 SPHK1 在胃癌组织中的表达

收集临床胃癌组织样本50 例和邻近非肿瘤组织34 例。经统计分析,SPHK1 表达与胃癌患者性别(χ2=0.277,P=0.610)、年 龄(χ2=1.054,P=0.267)不 相 关,与 病 理 分 期(χ2=9.141,P=0.003 5)、TNM 分期(χ2=7.257,P=0.007 3)、N 分期(χ2=4.957,P=0.025 1)相关,且存在统计学意义,见表1。

表1 SPHK1 表达与临床病理特点的关系Tab1 Analysis of SPHK1 expression and clinicopathological characteristics

为进一步探讨SPHK1 在胃癌组织中的表达情况,将对临床组织样本进行免疫组织化学染色。IHC 结果显示,见图7A,SPHK1 在胃癌组织中的染色强度和染色阳性面积均高于邻近非肿瘤组织,并且TNM 分期中胃癌组织染色强度TNMI、Ⅱ期弱于Ⅲ、Ⅳ期,提示SPHK1 表达可能与胃癌进展相关。通过IHC 染色评分,表明SPHK1 在胃癌组织中高表达,见图7C,差异具有统计学意义(P<0.001)。此外,经过Western Blot 检测,在9 例胃癌组织及配对的癌旁组织中,SPHK1 在胃癌组织和癌旁组织的表达中位数分别为0.903 和0.615,其蛋白水平表达在胃癌组织中高于癌旁组织,见图7B、D,差异具有统计学意义(P=0.026 5)。同时,验证了生信数据分析部分结果。基于此,以上数据进一步提示了SPHK1 在胃癌组织中高表达,可能与胃癌进展不良预后相关。

3 讨论

胃癌一般起病较隐匿,大部分病例在初步诊断时就已达到局部发展阶段,因而死亡率较高[19]。经过传统的手术与药物治疗的胃癌患者仍然有不良预后[20]。SPHK1基因在细胞生长和信号转导中起着至关重要的作用[21]。胃癌腹膜播散已被公认为晚期胃癌最常见的转移形式,SPHK1 驱动的人腹膜间皮细胞自噬加速了胃癌腹膜播散在体外和体内的发生[13]。Xia 等[22]研究发现,SPHK1 在胃癌中表达升高,而下调SPHK1 可抑制胃癌细胞增殖,并且与患者的生存时间缩短有关。通过紫外线照射人MGC-803 胃 癌 细 胞,SPHK1 通 过AKT/FoxO3a/Bim 途径赋予胃癌细胞凋亡抵抗力[23]。而SPHK1转录的ERK1 依赖性上调刺激胃癌细胞增殖[24]。这些结果预示SPHK1 将在胃癌诊断、治疗和预后预测过程中起着重要意义,进而为胃癌的精确诊断、治疗指明了新走向。在Qin 等[25]的研究中发现,SPHK1 通过NONO/STAT3 轴促进膀胱癌细胞中的顺铂抵抗,从而使肿瘤细胞产生免疫逃逸。在一项非酒精性脂肪性肝炎相关肝细胞癌临床病理分析研究中,通过免疫组化染色发现SPHK1 较正常组织具有高水平表达[26]。此外,Peng 等[27]研究表明高水平表达的SPHK1 在肺腺癌的发展进程中具有重要作用。与靶向治疗耐药相关的SPHK1 在预测肾细胞癌预后不良方面也呈过表达状态[28]。因此,胃癌进展中的靶基因研究更具有重要的临床意义[29]。这也为本研究提供了研究基础和方向。

在本研究中,基于TCGA 和HPA 数据库,SPHK1 在胃癌组织和癌旁组织中表达存在显著差异。IHC 和Western Blot 结果表明SPHK1 在胃癌组织中呈高表达趋势,这与生物学信息分析结果一致。通过进一步生物学信息检索,SPHK1 与肿瘤生长因子MKI67 表达呈现正向相关性。Kaplan-Meier Plotter 数据库还提示高表达的SPHK1 在胃癌中预示更差的生存期。而富集通路分析结果同样提示SPHK1 参与多种通路影响胃癌的发生、发展。肿瘤微环境中各种免疫细胞在癌症中的确切作用十分复杂[30,31]。淋巴细胞浸润可以通过树突状细胞免疫疗法诱导肿瘤浸润,这可能对临床结果产生积极影响[32]。本研究表明,SPHK1 的表达可能与3 种免疫细胞类型的浸润显著相关,提示SPHK1 不仅可以反映癌症患者预后,还反映免疫状态。此外,SPHK1基因在肿瘤细胞中的表达量最高,继而调节肿瘤进展。

综上所述,SPHK1 在胃癌中的作用显著,它可能是一个潜在的胃癌预后标志物。但本研究仍有一定的局限性,因而将进一步收集临床胃癌患者数据,随访分析5 年生存率。同时干扰SPHK1基因表达,从细胞层面探讨SPHK1 对胃癌细胞生物学行为的影响,继而深入研究胃癌发生、发展的分子机制。

作者贡献度说明:

凌潜龙:实验设计执行、数据库检索和论文撰写;管佳佳:参与部分数据库检索;纪凯与朱爽秋:参与部分基础实验;朱冰:参与实验设计、论文撰写指导。

所有作者声明不存在利益冲突关系。

道德伦理:蚌埠医学院人体伦理审批号[2023]第311号、405 号。

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