现代心肺复苏动物模型研究进展

汤红梅 综述 单怡 审校

1.上海市奉贤区中医医院急诊科，上海 201499；

2.海军军医大学第二附属医院(上海长征医院)急救科，上海 200001

心搏骤停(cardiac arrest，CA)是指心脏有效搏动突然停止。在美国，每年约有35万人发生院外心搏骤停(out of hospital cardiac arrest，OHCA)，而院内心搏骤停(in hospital cardiac arrest，IHCA)人数约为20万[1]。心搏骤停死亡率很高，即使复苏成功后，多数存活患者仍然遭受严重的缺血缺氧损伤，各脏器功能发生损害。因临床无法模拟实际心搏骤停的场景，故拟通过设计心搏骤停动物模型来模拟人类的心搏骤停事件，用于研究心肺复苏后机体发生的病理生理变化、优化心肺复苏流程[2]，提高CA患者的生存率及复苏后生活质量。

1 常用心肺复苏动物的选择

目前用于建模的动物有大动物、中等动物以及小动物[3-4]，不同的动物模型有其各自的优缺点[5]，其中应用最广泛的是猪，其次是大鼠、小鼠、兔子，以成年雄性动物为多。

1.1 大动物实验模型代表猪是一种大型哺乳动物，其心脏解剖和生理结构与人类相似[6]，传导系统的血供、冠脉血液分布、心肌组织学表现以及缺血损伤后的代谢、静息心率、血压、血清化学成分与人类非常相似[7]，且血容量较大，可满足实验所需的相关生化分析、血管内和心内压力检测以及静脉给药及治疗等。猪的胸廓宽大，对胸外按压及心脏除颤耐受较好，且脑组织体积大，可取得更多的组织标本。因此，73%的室颤模型选用猪[5]。一般选用成年雄性猪，有约克夏长白横猪[(80.0±6.0)kg]或12~14个月龄小型家猪[8][(25.0±2.0)kg]、北京长白猪[(30.0±1.0)kg]。但猪因体积庞大、麻醉难度较大，实验操作起来需要的人力较多，故造模成本较高。犬的神经系统较发达，修复能力弱，对于缺血缺氧损伤更敏感，能更好地模拟人心肺复苏后的严重脑损伤。一般有选用3~5岁雌性纯种小猎犬[9](7.5~13 kg)、雄性成年比格犬[10](10~12 kg)、成年杂种犬(10~15 kg)等行CA相关实验研究。羔羊的体质量、基线血压与胎儿接近，故在研究新生儿窒息领域有重要的价值。有实验研究羔羊在母体行剖腹产后行脐带结扎引起心脏骤停[11]，模拟围产期窒息模型，但实验成本高，实验操作技术要求高，国内相关研究甚少。猴的神经系统发达，与人类有很多相似的地方，有研究发现CA后猴的脑血管内存在大量血凝块，但因其本身的珍贵性及稀有性，故极少用来做心肺复苏模型。

1.2 中等动物实验模型代表家兔性格温顺、体型较小、实验成本低，家兔心脏具有左右心房及心室，动脉血压与人类也基本相似，兼有大小动物的一些优点，是近期较常用来CA建模的动物。国内实验研究多采用成年雄性新西兰大白兔(2~2.5 kg)、日本大耳白兔(2~3 kg)。有学者研究兔CA后氢气干预可降低心肌糖代谢，以及CA后不同时相亚低温治疗对兔脑功能的影响。国外有选用成年龙猫杂种兔[12](1.5~2 kg)研究Olesoxime对心肌缺血再灌注损伤的保护作用。

1.3 小动物实验模型代表啮齿类小动物如大鼠和小鼠相对实验成本低，操作方便，且其都有左右心房和心室组成，和人类相似。不同的是大鼠心率为260~450次/min，小鼠心率为500~600次/min。因大鼠基础心率快，相对不应期短，具有自动复律及除颤功能，故诱导室颤时需要持续低强度电流维持，所需致颤时间较长。大鼠神经系统相对不发达，心肺复苏后很少出现意识障碍及脑干功能衰竭，与人脑对缺血缺氧损伤异常敏感的生理病理特点不同，在模拟严重缺氧性脑病时与临床情况有一定差别。国内研究一般选用健康成年雄性SD大鼠[(466±45)g]行CA后相关实验研究，也有学者选用10周龄Sprague-D awley大鼠[13][(310~320)g)行CA后观察到低温(32℃)治疗可减轻神经损伤。还有选用昆明小鼠[(30~40)g]研究发现戊巴比妥较水合氯醛更适合CA动物麻醉。

2 常用诱导心搏骤停的实验方法

诱导心搏骤停常用的方法有电击致颤法、窒息法和氯化钾停跳法。2017年发表在《Resuscitation》上的综述总结了2011—2016年CA的动物模型文章，其中电击致颤占54%、窒息占25%、高钾占8%、冠状动脉结扎诱导急性心肌梗死占2%、毒物占3%、大血管闭塞占1%、张力性气胸，还有几种方法的组合等[5]。其中，电击致颤模型中猪使用最广泛，窒息模型中多使用大鼠，高钾模型中多使用小鼠。

2.1 电击致颤法诱导CA经右心导管交流电诱发室颤，这是最经典的电击方式，致颤的结果是心脏无法维持正向血流。以大鼠为例：对致颤大鼠的一侧颈外静脉置入绝缘导管约4 cm，导管中插入导丝，剑突下皮下组织处置一侧电极，根据血压波形，判断导丝是否进入右心室，2.5 mA通电诱颤，观察大鼠血压及心电图变化，调整诱颤导丝位置，直至心电图呈室颤心律。致颤2.5~3 min后关闭电源，见自发室颤[14]。大动物中以猪为例[15]：给猪行右侧股静脉置管至右心室，胸壁皮下组织插入另一电极，采用30~60 mA交流电通电10 s诱发室颤。经胸壁体外电击诱导室颤：经胸壁以60~70 V直流电电击5 s或50~110 V交流电电击1~2 s，可重复电击多次，直至心电图出现室颤。经食道-胸壁电刺激诱导室颤：经食道插入食道调搏电极至心脏水平，同时将另一电极插入动物胸壁皮下。多项研究表明：6 mA、4 ms、50 Hz可以达到最小损伤且稳定致颤的目的。开胸直视电击诱导室颤：将麻醉后家兔开胸直视下采用1 V交流电诱发室颤4 min，并在直视下行心脏按压及药物复苏治疗。

2.2 窒息法诱导CA窒息法是指在呼气末通过气管插管管口堵塞或气管切开后夹闭气管来模拟呼吸道梗阻，造成窒息缺氧致心跳停止。大鼠在窒息动物模型中占46%[5]。窒息所致的心搏骤停不同于室颤，室颤是突然发生的，而窒息是一个逐渐发生的过程，可合并有严重呼吸性酸中毒。故窒息致心搏骤停模型会导致更严重的心、脑、肾和弥漫性微循环障碍[16-17]，利用PET-CT检查发现猪窒息后致脑代谢的损伤明显重于室颤法[18]。

2.3 高钾诱导CA将10%氯化钾溶液快速注入动物静脉或心腔，可快速导致CA。此法操作相对简单，但因致CA时心电图常呈无脉性心电活动或者心室静止，和临床某些先室颤后演变为心室静止情况有一定差别，且推注高钾引起动物体内电解质紊乱，故采用此法时需注意电解质紊乱对实验结论的影响。

2.4 冠脉结扎或闭塞发生急性心肌梗死诱导CA1946年，Heimburger等[19]第一个结扎大鼠冠脉制作急性心梗模型。将大鼠左前降支或左回旋支闭塞后的前30 min内，73%~100%的动物发生室速(VT)，57%~89%的动物发生室颤(VF)。猪可通过穿刺股动脉，用标准的6-F冠脉介入导管置入优势冠脉口，用标准的血管成型术球囊充气至8 atm，封堵冠脉，经冠脉造影确定无血流通过，建立急性心梗模型。继而观察心电图及动脉血压变化，若实验动物出现室颤、电机械分离或动脉压力曲线波为直线，则提示CA造模成功。

2.5 其他方式诱导CA如放血疗法使动物出现失血性休克而建立CA模型。利用大型猪(70~90 kg)制作出血引起的创伤性心脏骤停模型(TCA)等。此种方法导致的血压降低是渐进性的，不会发生心脏节律或心电图的突然改变，干扰因素较多，且创伤较大，感染机会多，只能短期观察生存率，不适合做长时间监测。除此之外，还有窒息合并颈内静脉注射冰氯化钾、毒物或药物致CA模型等。

3 心搏骤停造模流程

3.1 麻醉方式实验动物术前12 h禁食不禁水。麻醉方式有吸入麻醉，静脉、腹腔、皮下、肌肉注射等。常用的麻醉药物有戊巴比妥钠、氯胺酮、氟烷、异丙酚、安定、异氟醚等，目前应用最多的是戊巴比妥钠。大鼠为5%戊巴比妥(45 mg/kg)腹腔麻醉，之后以10 mg/(kg·h)补充麻醉；小鼠为1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉；大型动物如猪等。一般予以氯胺酮(20 mg/kg)臀部肌肉注射诱导麻醉，经耳缘静脉予以3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)静脉麻醉，另予以8 mg/(kg·h)持续镇静治疗，维持动物麻醉状态，阿托品0.25 mg臀部肌肉注射防止过多分泌物分泌。

3.2 造模前准备及生命体征监测诱导CA前完成人工气道、动静脉置管后，监测心率、平均动脉压、呼气末二氧化碳分压、基线血气分析，若上述指标均正常，则考虑实验动物术前准备达标。在整个实验过程中，始终用电热灯泡或电热毯控制动物肛温在(37±0.5)℃。如气管插管过程中出现心搏骤停，予以心肺复苏的动物或者有大出血、基线平均动脉压及心率、呼气末二氧化碳分压不能维持在正常范围的，则弃用。

3.3 复苏过程根据不同的实验设计进行心肺复苏。大鼠按压位置为剑突上3 cm，幅度为胸廓前后径的1/3，气管插管连接小动物呼吸机吸入100%氧气浓度，按压与通气比例为2∶1。当复苏过程中心电图呈室颤波时，给予2 J双向电除颤一次，除颤后立即恢复胸外按压，2 min后再次判断，必要时再次除颤。复苏过程中可给于肾上腺素等辅助药物。大动物如猪，按压位置为胸骨中下1/3，按压频率为100~120次/min，深度为胸廓前后径的1/3；以100%的氧气浓度恢复机械通气。出现室颤波时给予150 J的双向波电除颤一次，并判断是否恢复自主循环。胸外按压方式有手动按压、小动物胸外按压机、萨博机以及改良的缝纫机。

3.4 捐献(Donor)动物在实验过程中需备有Donor动物，尤其是小动物的血容量较少，在动静脉置管过程中可能会出现出血较多、手术时间较长的情况，为了保证实验动物的正常血压及完成后续相关造模实验要求，保证实验前基线水平的一致性，需要准备若干只Donor动物，来补充实验动物的失血量。

3.5 几个相关概念Utstein标准(1996年)：是最为常用的呼吸心搏骤停标准，即动脉收缩压＜25 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，心电图显示为室颤或无脉电活动。无灌流时间：即从心脏停至到心肺复苏开始的时间[5]。自主循环恢复(ROSC)[20]：从开始进行标准心肺复苏至出现自主心律，脉搏波、收缩压≥60 mmHg且维持10 min以上。复苏失败：持续抢救15~30 min以上自主循环仍未恢复。

4 心搏骤停模型器官功能的相关研究

4.1 神经系统

4.1.1 脑灌注及脑血流文献综述分析在成年动物CA模型中皮层和皮层下都有低灌注，灰质更容易发生。动物模型CBF的评估有激光多普勒探头[21]、静脉注射微球、自动放射成像法[22]、激光散斑流量法、光学成像法等微创方式以及CT、SPECT、MRI等无创方式。

4.1.2 组织病理学CA诱导的神经元坏死在海马、纹状体和大脑皮层。Choy等[23]对CA后的皮质神经退行性变也有报道。Coimbra-Costa等[24]研究证实与海马CA1区相比，新皮层对缺氧再灌注的敏感性较低。Keilhoff等[25]制作窒息性大鼠心脏骤停模型(ACA)研究结论显示：ACA后，皮质呼吸链复合物活性增加，线粒体作为ACA诱导细胞应激后能量需求增加的反应，其ATP的合成增加，线粒体MnSOD快速、有效、持久的防御。

4.1.3 生物标志物蛋白最新研究发现：血清神经丝轻链(Nfl)[26]在CA患者中血清浓度与生存率呈负相关，在预测患者预后上优于NSE。miRNA为最新缺血缺氧性脑病可预测性的生物标记物，研究表明：在围产期窒息及新生儿缺血缺氧脑病的患儿中，脐带血miR-374a和miR-376c的表达降低[27]，在小猪模型中也有类似结果。同时，肌钙蛋白T也被认为是一个脑损伤的生物标志物。S-100B是早期急性神经损伤生物标志物中研究较多的一个蛋白[28]，CA后24 h血清浓度达峰值，但它也存在于其他组织，故在神经预测方面缺乏特异性[29-30]。髓磷脂碱性蛋白(MBP)是持续的急性神经损伤生物标志物[28]。MBP免疫反应性被用于评估猪心脏骤停模型脑组织髓磷脂的损失[31]，MAP浓度与预后呈负相关[32]。有学者对新生仔猪缺血缺氧性脑病研究发现：脑脊液中S100A8水平增加最多(9.5倍)，CDH2水平下降最多(0.3倍)，血浆中FABP1显著增加31.8倍，这可能与缺血缺氧性脑病后的脑损伤直接相关[33]。另血浆中SOD1表达增加，破坏体内氧自由基，可改善脑损伤的预后。干细胞移植是脑复苏研究领域新的热点。有学者研究骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)在大鼠全脑缺血缺氧损伤的保护作用和机制。通过窒息法诱导大鼠心搏骤停，并予以心肺复苏，ROCS后1 h经大鼠尾静脉注射BMSCs，研究发现BMSCs可能通过分泌胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor-1，IGF-1)起到营养神经的作用，从而改善心肺复苏后大鼠的神经功能。

4.2 心脏有实验通过电诱导室颤法致大鼠心脏骤停后进行心肺复苏，于各观察点动态观察大鼠复苏后心脏结构和功能的动态变化及血清心肌酶学、线粒体呼吸功能及组织病理学，结果发现：在全心缺血-再灌注的过程中，心肌线粒体呼吸功能下降，超微结构受损，能量生产障碍；心超提示：心室壁增厚并心肌做功指数增加；组织病理学可见间质增生[34]。但至于心肌细胞能否逆转等，因实验动物及条件的限制，目前暂不太清楚。笔者自己在做大鼠室颤致CA模型的时候，ROSC后观察至72 h，取心脏标本时有一只大鼠出现严重的心肌肥厚，左室壁肥厚，左心室腔明显变小，同时还有纤维化表现。但在猪的心肺复苏模型中，有研究者发现复苏后心功能恢复大约需要24~48 h。有实验证明，复苏大鼠心肌中K-OR的基因和蛋白表达水平较正常增高，K-OR的保护性上调与复苏后心功能障碍的发生相关；K-OR激动剂对复苏后心功能有保护作用，在缺血早期激活K-OR心肌保护作用更好。有学者通过大鼠CA模型研究普罗布考对大鼠心脏骤停的保护作用及其可能机制，结论显示普罗布考可减轻大鼠CA诱导的氧化应激，改善血流动力学参数和心脏功能，可提高大鼠ROSC率和存活时间，这种保护作用可能是通过KEAP1-NFE2L2系统的调节产生的[35]。

4.3 肾脏及肝脏Tissier等[36]通过对兔实行室颤致CA模型实行全弗化碳液体通过实行低温处理，发现其对复苏后肾功能是有保护作用的，也增加了肾脏器官捐献的可实用性。

4.4 凝血功能CA和CPR后激活体内炎症因子发生DIC，中性粒细胞和血管内皮细胞激活。IL-1激活了下丘脑-垂体-肾上腺轴，产生大剂量肾上腺素，与纤维蛋白血栓形成有关。另血小板被激活，但血小板聚集下降[37]。动物实验也证明：犬在CA后脑血管内存在大量的血凝块，肝素可降低死亡率。家兔的肺、脾、肝脏在CA后均有血管内纤维蛋白血栓形成。DIC最终导致多器官功能障碍，这是影响心搏骤停后综合征预后的一个重要因素。

4.5 炎症感染有研究发现FTY720对CA后大鼠起抗炎、抗氧化、抗凋亡作用，减轻心脏炎症反应及心肌损伤，改善心功能[38]。CA后患者体内类固醇激素水平越低，患者预后越差；反之，IL-6水平越低，则预后越好[39]。应激剂量的类固醇可增强血管紧张素的作用，减少器官功能损伤。

4.6 免疫系统有学者研究发现CA后存活一周的患者体内CD73表达水平和预后呈正相关，其主要是通过促进血管内皮生长因子的分泌和抑制髓样细胞的炎症激活起炎症保护作用[40]。

5 结语

综上所述，通过制作动物CA模型，可以为临床不同发病病因所致的心搏骤停以及心搏骤停后人体重要器官功能改变、组织病理学、生化指标、特异性生物标记物等的变化提供实验依据。但实验动物一般采用的都是健康成年动物[41]，而临床实际中，发生心搏骤停的患者一般都是老年人且合并多种慢性病，所以动物实验的数据及相关结果可能与临床实际还是有一定的差别。我们需要在不断的摸索学习中，找到两者之间的平衡点，更合理地将动物实验结果应用于临床。