肿瘤教化血小板转录组中miRNA区分肺结节良、恶性的可行性研究进展

吕尧兰 综述 金健 审校

1.遵义医科大学，贵州 遵义 653000；

2.成都大学附属医院胸心外科，四川 成都 610036

肺癌是全世界范围内发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一，也是我国近30年来发生率增长最快的恶性肿瘤。2020年全世界肺癌发病率和死亡率均居前位，新发病例约220万，死亡约180万[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)早期临床表现缺乏特异性，多年来国内外一直致力于通过筛查来实现NSCLC的的早诊早治，以期降低NSCLC的相关死亡率，但效果欠佳，即使是接受了根治性手术的NSCLC患者，也有45%在8~18个月内出现复发或转移[2]。尽管在诊断和新型靶向药物方面取得了新进展，NSCLC的预后仍然很差，因为生存时间与NSCLC的临床分期直接相关，不同的临床分期的预后有着显著差异，所以NSCLC的早期诊断和有效的治疗是延长生存时间的有效方法，能使患者有更好的转归。

目前临床上常用的NSCLC诊断技术有：影像学、实验室(病理)、内窥镜以及近年兴起的液体活检等方法。其中液体活检是一种分析血液等非实质性生物组织来诊断或检测肿瘤的方法[3]，具有低创伤、标本易获取、可以反映肿瘤的整体状态、实现实时检测等优点。其中肿瘤教化血小板(tumor-educated platelets，TEPs)作为新型液体活检标志物来源，其转录组中MicroRNA(miRNA)是目前用于检测早期NSCLC的热门生物标志物。本文就TEPs转录组中miRNA区分肺结节良、恶性的可行性进行综述。

1 TEPs概述

TEPs是指恶性肿瘤患者中的癌细胞与血小板相互作用时，通过多种方式影响血小板RNA表达谱的血小板[4-5]，被认为由癌症存在时的局部和系统性应答转化而来[6]。TEPs是含有肿瘤RNA的血小板，是肿瘤源性RNA的重要来源[4]。血小板不仅可以根据肿瘤释放的信号进行剪接，血小板与肿瘤释放的某些生长因子的相互作用也会改变血小板中存在的mRNA的表达。这种由于血小板与肿瘤相互作用而导致的血小板内mRNA的差异表达可被用作早期癌症检测或癌症转移的生物标记物[7]。

1.1 血小板生理血小板来源于骨髓巨核细胞的无核循环细胞片段，具有动态的生物学功能，包括止血、动脉血栓形成、免疫、炎症、血管重塑和血管生成[7]。血小板大量存在于血液中，是外周血中第二丰富的细胞类型[8]。研究表明肺对血小板生成的贡献很大，约占血小板总产量的50%，并通过实验证明肺是终末血小板生成的主要场所，也是具有相当造血潜能的器官[9]。也就是说，当肺部存在结节时，血小板可能会从结节组织中穿过，受到结节的影响从而改变自身的RNA，为研究提供了理论依据。而通过RNA结合噻唑橙染色测定，年轻的网状血小板的总RNA浓度增加了20~40倍[10]，这表明年轻的血小板含有更多的(未切割的)RNA，这些RNA可能在血小板循环或激活时衰变或释放，在血小板激活之前提取RNA，可以获得大量RNA。目前发现的血小板含有丰富的RNA种类，包括mRNA(前RNA和mRNA)、核糖体RNA(r-RNA)、microRNA(miRNA)、小核RNA(snRNA)、小核仁RNA(snoRNA)、反义RNA(as-RNA)和转移RNA(t-RNA)[11]。其中，MicroRNAs(miRNA)是一个小的非编码RNA家族(21-25个核苷酸)，可以通过碱基配对到靶信使RNA(mRNA)的互补位点来抑制mRNA的翻译和促进mRNA的降解[12]。通过这种机制，miRNA在转录后改变了基因表达，而这种改变能够被发现，借以观察肺良、恶性结节之间的差异性。

1.2 血小板与肿瘤细胞血小板与肿瘤细胞之间存在相互作用。一方面，肿瘤细胞可以“教育”血小板，影响循环血小板的数量和激活状态，并使其转录组发生剪接或拼接，导致功能发生改变；另一方面，肿瘤教化的血小板含有过多的活性生物分子，包括血小板特异性和循环摄取的生物分子，这些生物分子在血小板活化后释放并参与恶性肿瘤的进展。NSCLC患者外周血中TEPs可能处于“半激活”状，这就使得血小板容易被肿瘤细胞激活或者聚集[13-14]，激活后的血小板可能改变了原有的miRNA序列，使其与健康人、良性结节之间的miRNA存在表达差异，应用二代测序技术检测并分析miRNA表达差异序列，就有可能区分早期NSCLC与健康人、良性结节。

2 TEPs应用

血液的液体活检是目前肿瘤研究的热点，已有部分应用于临床，具有以下优势：(1)早期发现癌症(筛查)；(2)确定个性化治疗的新靶点；(3)预处理治疗反应；(4)早期治疗反应监测和“实时”评估治疗效果；(5)早期发现疾病复发[10,15]。其中TEPs具有数量大、易提取、拥有大量RNA等特点，在NSCLC的早期诊断领域具有深入研究价值。

2.1 TEPs RNA与NSCLC目前临床上肺部常用的早筛方法存在较多局限，而基于血液的TEPs具有微创性、重复取样可能性、较低成本等优点[16]，且大量研究提出TEPs检测早期NSCLC有较高的检出率。2015年Best等[17]首次使用Thrombo-Seq技术评估肿瘤患者与健康人的TEPs mRNA表达谱，以96%的准确率区分癌症患者和健康人。在6种肿瘤类型(NSCLC、胶质母细胞瘤、结直肠癌、乳腺癌、肝胆癌和胰腺癌)中正确地确定了肿瘤的位置，准确率为71%。之后，该团队证明了粒子群优化算法(PSO)能使早期和晚期NSCLC的TEP检测准确率提高至81%、88%，并独立于个体年龄、吸烟习惯、全血储存时间，PSO算法对NSCLC诊断的准确性随着样本的增加而提高，与年龄、吸烟状况、血液储存以及各种炎症状态无关[18]。在此团队之后，其他团队也证实了检测TEPs的RNA序列在NSCLC早期筛查中的应用。Sheng等[19]通过分析NSCLC患者和健康对照组TEP-RNA的测序数据，鉴定了48个TEP生物标志物，这些生物标志物可以准确筛查出NSCLC患者；Zhang等[20]应用RNA-seq检测健康人和NSCLC患者的血小板，结果显示血小板RNA-Seq在区分肿瘤组织学类型方面具有诊断潜力。由此可见，TEP-RNAs可作为肿瘤的生物标志物，且在NSCLC的早期诊断中的地位越来越重要，是个体化治疗的基础之一。

尽管上诉研究已经阐明了TEPs转录组在NSCLC中的应用——通过分析TEPs mRNA表达谱，以较高的准确率区分癌症患者和健康人，但大多数研究包含过多晚期病人，且对照组只选择健康人，或无良性对照组，重点在于区分健康人和NSCLC患者，对于结节的良恶性并没有给出明确依据。而随着科技进步，人们健康意识的提高，越来越多的人通过体检发现肺部存在结节，其中有大部分结节，临床上也无法准确判断其良、恶性。据报道肺结节诊断或治疗学手术中有30%~50%的术后病理诊断为良性[21-22]，从而导致不必要的手术，造成医疗资源浪费，家庭社会负担加重。因此，筛查出肺部结节的良、恶性才是目前研究的重点难点。

2.2 miRNA与NSCLCmiRNA是一类内源性的、单链的、小的非编码RNA分子(21~25个核苷酸)，对基因表达的转录后调节至关重要[23-25]，相对稳定、体积小、基因表达调控显著是miRNA区别于mRNA的独特特征，是一种新的生物标志物和潜在的治疗靶点[26]，miRNA被发现在NSCLC中经常失调，并且与NSCLC的生长、复发和转移有关[27-28]。因此，miRNA被认为是诊断NSCLC的有价值的生物标志物。

近年来对miRNA的研究如雨后春笋般快速进步，越来越多证据证明miRNA是诊断癌症的重要标志物来源。其中Chen等[29]在400例NSCLC患者和220例对照组中，从全基因组血清miRNA表达谱中鉴定10种血清miRNA作为非小细胞NSCLC诊断新的无创生物标志物；此外，Akanksha Khandelwal等[30]通过实时定量PCR检测NSCLC患者血浆样本中的miRNA，结果表明miR-590-5p通过调节STAT3通路在NSCLC中发挥抑癌作用，可能作为NSCLC诊断的有用生物标志物，并作为NSCLC治疗的潜在靶点；Zhang等[31]通过qRT-PCR分析了81例NSCLC患者肺肿瘤组织及其配对的非肿瘤组织标本进行miRNA和mRNA芯片分析，结果提示miRNA可能在NSCLC的发生发展过程中起重要作用，可能是NSCLC的有效诊断标志物。上述研究提供了可靠的证据，证明miRNA谱的改变可能使miRNA成为肿瘤早期诊断可靠生物标志物。而有部分研究表示miRNA已被证明是NSCLC早期检测的可靠生物标志物[32-33]。尽管研究中的miRNAs来源各不相同，但均需提取出稳定的RNA，不可否认的是，在外周血中也可检测到稳定形式的肿瘤相关miRNA，且TEPs中的miRNA更稳定、含量高、且不易受到酶的影响。因此,TEPs转录组miRNA有望成为NSCLC高危人群早期筛查的重要生物标志物。

此外，Xing等[34]证实血小板RNA测序可以识别用于NSCLC检测的TEP生物标志物，用定量实时聚合酶链反应(q-PCR)对NSCLC患者、良性肺结节和健康对照者进行检测，提取和检测血小板转录组不仅可以区分癌症患者和健康人，而且还可以进一步区分鳞癌和腺癌、区分癌症和良性结节。而Florczuk等[35]从循环外显体分离的miRNAs作为区分肺腺癌和肉芽肿的标志物更是为miRNA区分肺结节的良、恶性提供可靠依据。相较于外显体，血小板在提取技术上较完善、提取方法也较为简单，且拥有大量RNA，有研究表明含有大量的动态mRNA的血小板可应用于肿瘤的诊断[36-37]。因此，基于血小板转录组检测的液体活检具有数量大、易提取等特点，在肿瘤的诊断领域具有深入研究价值。

3 展望

肺癌是目前世界上死亡率较高的恶性肿瘤，我国第三次死因回顾调查显示肺癌居于癌症死亡原因首位，在高危人群中开展肺癌筛查有益于发现早期肺癌，提高NSCLC的生存率。欧洲肺癌筛查试验最新研究显示，通过低剂量螺旋CT(LDCT)筛查，男性NSCLC死亡率降低24%，女性NSCLC死亡率降低33%[38]，总的来说，LDCT筛查显著提高了Ⅰ期NSCLC的检出率，降低了NSCLC死亡率。临床上常用的生物标志物在晚期诊断中比早期更准确，而IA期NSCLC患者5年生存率约为80%，Ⅲ期NSCLC患者5年生存率仅为20%左右，因此，在发现肺部结节之后，能否通过非手术方法有效的发现其良、恶性，是亟待解决的问题。

近5年，关于各类肿瘤液体活检的研究显著增加，液体活检检测的主要成分包括循环肿瘤DNA(ctDNA)、细胞外囊泡(EVs)、循环肿瘤细胞(CTC)，以及TEPs等，但研究表明在高度侵袭性的NSCLC患者血液中CTC和ct-DNA含量非常低，特别是在早期NSCLC患者的血液中含量更低。而基于外泌体诊断NSCLC的研究也是如火如荼，已取得一定成绩，但提取方法过于复杂，临床推广性较差。TEPs作为新型液体活检来源，相对于其他液体活检来源来说，具有丰度高、易分离、易储存、易检测等优势，且其中的RNA受到血小板的保护，比较稳定，不易受内源性RNA酶的影响[39]，因此TEPs转录组中miRNA在肺结节的性质诊断方面有着巨大的潜力。在前期工作中，研究团队收集了部分NSCLC以及肺良性结节、正常健康人血小板，并提取总RNA检测miRNA谱，发现肺腺癌与肺良性结节在部分区域表达有着显著差异[40]，从而说明血小板转录组分子标准物具有进一步研究价值。

TEPs为区分癌组织和非癌组织的潜在生物标志物提供了一个有前途的新来源，这也是未来基于血液的生物标志物研究中能够进一步扩展的。随着人们健康意识不断提高，肺部结节也不断被发现，为了减少社会及家庭负担，避免医疗资源浪费，明确肺部结节的性质是目前亟待解决的问题。目前许多关于miRNA的研究依然不少，然而，miRNA在临床上进行诊断的应用却不容乐观，主要原因是不同研究之间缺乏可重复性，而这种不一致的原因可能是血小板miRNAs水平的个体间变异；另外，由于病例数量有限，现仍缺少大规模研究。为使miRNA能更广泛应用于临床，需要提升检测技术的灵敏度和特异性、扩大临床试验规模。