基因组学技术在关节病型银屑病中的应用

古元霞，王怡怡，肖月，李薇

银屑病是一种慢性的炎症性疾病，约有1/3的患者会进展为关节病型银屑病(psoriatic arthritis, PsA)。PsA的表现具有异质性，可不同程度影响中轴和外周关节，影像学表现为滑膜炎、指趾炎、附着点炎、骶髂关节炎等。PsA表现为多基因遗传模式，一项加拿大的研究[1]显示PsA一级亲属再患PsA的风险率比患银屑病的风险率更高，提示遗传因素在PsA中具有更重要作用。不同的基因组测序技术包括人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)分型、全基因组关联分析(genome-wide association study, GWAS)、全外显子测序(whole exome sequencing, WES)等基因检测技术已广泛应用于临床和科研，探索PsA患者与单纯银屑病患者之间的差异基因作为银屑病患者发展为PsA的遗传标志物。此外，近年来以超长读长为优势的三代测序技术也在遗传疾病中得到应用。下文就基因组学技术在PsA中的研究进行阐述。

1 HLA分型技术

HLA分型技术被用于疾病易感基因的探索，且常常将其与疾病的临床表型进行关联分析。目前HLA分型实验室采用的检测方法主要有:序列特异性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primer, PCR-SSP) 方法、序列特异性寡核苷酸探针(sequence-specific oligonucleotide probe, SSO) 方法和以测序为基础的分型技术(sequence based technique, PCR-SBT) 方法。基于PCR及单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)的HLA分型技术，银屑病的遗传易感性和临床表型有了更为广阔的研究。

1.1与PsA相关的HLA位点 银屑病与主要组织相容性复合体区域之间存在强关联，在该区域内，既往研究[2]一致认为PsA与HLA-C*06之间存在很强的相关性。在人群研究中，Ⅰ类抗原(HLA-B13、HLA-B57、HLA-B39、HLA-Cw6、HLA-Cw7)一直被认为与银屑病和PsA呈正相关，其中银屑病与HLA-Cw6的相关性最强。虽然与普通人群相比，PsA患者的HLA-C*06也增加，但与单纯银屑病相比，这种相关性更强。一项基于人群的研究[3-4]纳入728例PsA与404例寻常性银屑病患者，发现与寻常性银屑病患者相比，PsA患者中HLA-B*27、HLA-B*38和HLA-B*08的等位基因频率更高，而HLA-C*06等位基因在PsA中的等位基因频率更低；HLA-B*39等位基因单核苷酸多态性与PsA中轴受累的发生有关。

2008年，一项基于中国人群的研究[5]发现在PsA和银屑病患者中，HLA-B27多态性在PsA和HLA-A*30、-Cw*06、-DR*07多态性在银屑病患者中的发生频率显著高于健康对照组。相比之下，健康对照组的HLA-B*58多态性比PsA组和银屑病组更常见，健康对照组的HLA-DR*17多态性发生频率显著高于银屑病组。PsA和银屑病相比，HLA-B*27和HLA-Cw*12在PsA患者中的等位基因频率更高，而HLA-DR*07在银屑病患者中的等位基因频率更高。在PsA患者中，HLA-B*27与中轴关节受累和葡萄膜炎之间存在显著相关性。

2012年，Eder等[4]通过一项基于家庭的关联研究来证实这些结果。共纳入178例PsA患者、30例银屑病患者和561名一级亲属，进行HLA-B和-C基因分型。发现与银屑病相比，有4个HLA等位基因在PsA组中存在过度遗传现象：HLA-C*12、HLA-B*38、HLA-B*39、HLA-B*27。

2013年，Chandran等[6]采用病例对照设计，对678例PsA患者和688例健康对照进行HLA分型分析，并对283个家系行关联分析，发现HLA-C*12/B*38、HLA-B*27和HLA-C*06/B*57是与PsA密切相关的单倍型。

1.2HLA基因型与PsA的不同临床表型相关 HLA基因型可帮助识别具有特定PsA表型的患者：HLA-B27基因多态性PsA患者常伴脊柱受累，而B38和B39基因多态性的PsA患者常伴外周多关节炎。部分研究[7]利用HLA分型技术进一步探讨易感基因与PsA临床表型多样性的相关性，发现HLA-B*27：05：02与附着点炎、指趾炎和对称骶髂关节炎呈正相关；HLA-B*08：01：01-C*07：01：01与关节融合和畸形、不对称骶髂关节炎和指趾炎呈正相关；HLA-C*06:02:01与不对称骶髂关节炎呈负相关。

PsA与HLA等位基因的Meta分析结果表明:与PsA存在关联的有 60个HLA 等位基因，其中31个保护基因，32个风险基因，风险基因和保护基因中有 3 个重复基因[8]。

基于已经发现的HLA-B27基因，HLA-B27基因分型技术也有部分应用。2008年巴西一项研究[9]纳入102例PsA患者，发现其中21%患者HLA-B27阳性，其中B2705、02、04亚型较健康人群中更常见。西班牙的另一项研究[7]纳入282例PsA患者，24%患者HLA-B27阳性，其中B2705多态性最为常见。上述研究结果提示PsA与强直性脊柱炎具有相似的遗传易感性。

2 GWAS

GWAS基于大样本队列基础，将人群中获得的基因型与临床表型进行群体水平的统计学分析，能够发现与不同表型相关联的单核苷酸多态性。经过多个大型队列的积累、复杂的数据管理和结果的验证，既往研究发现染色体上PSOR1～9为银屑病的易感基因，并定位了数个HLA区域的易感基因。随后，在非MHC区域也发现了银屑病的易感基因。到目前为止，已发现80多个银屑病的易感基因。包括①表皮屏障通路：LCE;②抗原提呈：HLA、ERAP1、ERAP2、MICA；③IL-12/23轴：IL-12B、IL-23A、IL-23R、Tyk2、Jak2；④T细胞极化：RUNX1、RUNX3、STAT3、TAGAP、IL-4、IL-13；⑤固有免疫：CARD14、c-REI、IFIH1；⑥负向调节相关：TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、ZC3H12C、IL36RN、SOCS1。其中， IL-12/IL-23SNP的发现为生物制剂靶向治疗提供了依据。

但是阐明PsA的易感基因是一个更大的挑战，因为只有少数与炎症性关节病相关的基因与银屑病无关，大多数与PsA相关的候选位点也与银屑病相关。目前国内外主要有5个针对PsA的易感基因GWAS研究[10-14]，研究结果发现MHC区域的HLA-Cw06、HLA-B27、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B08、HLA-Cw*12、HLA-DR7、HLA-DRB1*0402等[15]，及一些单倍型，包括HLA-B* 18-C*07、HLA-B*27-C*01、HLA-B*27-C*02、HLA-B*38-C*12、HLA-B*08-C*07、HLA-B*57-C*06等[12]，非MHC区域的TNF、KIR2DS2、TRAF3IP2、TNIP1、REL、IFIH1、NFKBIA、IL13、IFNLR1、RUNX3、LCE、MICA、ERAP2等均与PsA易感性相关。2019年，中国利用Sequenom′s Mass ARRAY system平台验证NFKBIA可能是区分PsA与银屑病的易感基因[16]。

然而，GWAS最终只能提示疾病与表型的关联性，而不能验证基因到疾病的因果性，因此，联合其他组学共同验证基因在疾病中的作用机制通路是必不可少的。

3 WES及三代测序的特点及优势

WES是利用目标序列捕获技术，将全基因组编码基因外显子区域的DNA捕获并富集后，进行高通量测序的基因组分析方法。在具体应用方面和全基因组重测序类似，通过测序可以找到大量的SNP位点，插入缺失位点(insertion/deletion, InDel)、杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)、拷贝数变异(copy number variation, CNV)以及基因组重排导致的结构变异位点(structure variation, SV)，该技术对于发生在外显子区的常见和罕见的结构变异具有很高的检测灵敏度。该技术在寻常性银屑病患者中的应用发现了与阿维A、甲氨蝶呤疗效相关的SNP位点[17-18]，并揭示了CRAD14突变的幼年早发性红皮病型银屑病患者需要大剂量乌司奴单抗治疗[19]。

三代测序的纳米孔测序技术依赖于纳米级蛋白质孔或“纳米孔”，该孔用作生物传感器，并嵌入在电阻聚合物膜中。在电解溶液中，施加恒定电压以产生通过纳米孔的离子电流，从而使带负电荷的单链DNA或RNA分子从带负电荷的“顺式”侧穿过纳米孔，到达带正电荷的“反式”侧。迁移过程中离子电流的变化对应于传感区域中存在的核苷酸序列，并使用计算算法进行解码，从而实现单分子的实时测序。

基于以上原理，纳米孔测序技术读长可达到10 kb，无需逆转录的过程直接对RNA进行测序，检测DNA和RNA修饰，结构变异，进行重复序列分析、单体型分析；不进行PCR，直接测序可以全面覆盖端粒、着丝粒等区域，实时获得基因修饰等信息，如5mC、6mA等碱基修饰[20-23]。三代测序技术克服二代测序读长短的特点，具有读长长、无需构建PCR文库，可直接检测甲基化修饰等优势，已逐渐在病原体检测、复杂遗传病基因检测中得到应用——神经元核内包涵体病与 GGC 重复序列扩张有关[24]。

PsA为多基因遗传模式的疾病，具有高度复杂的遗传背景，其发病机制未明，利用三代测序技术对重症PsA患者及其家系测序可能发现未知的结构变异、定位其变异来源于父系或母系，完善发病机制通路。之前的研究[25]已表明CD8+T细胞中的DNA甲基化模式可区分单纯银屑病和PsA，并与后续治疗相关。对PsA患者在进行三代测序同时可进行甲基化检测，有助于发现表观遗传因素在PsA发病中的作用并观察治疗前后DNA甲基化的改变。然而，该技术目前仍然限于某些特定学科的应用，但其独特的优势应用于PsA后能为PsA的发病机制、治疗反应特点作出更好的阐明，有助于临床用药决策。

4 总结

不同的基因组学技术的应用丰富了PsA的遗传背景，然而，也需要更多的分子生物学技术等基础研究去进一步验证所发现的易感基因，从而为PsA的发病机制及治疗提供更坚实的理论基础。