cAMP/PKA通路在HPV16/18相关宫颈癌中的表达情况及临床意义

付小玲 郭 哲 许 静

宫颈癌是一种最为常见的恶性肿瘤，是导致女性恶性肿瘤死亡的主要原因之一。据临床研究显示，宫颈癌发生及发展的因素较多且复杂，导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的危险因素之一是人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染，目前已知的与宫颈癌发生存在紧密关系的两类高危型HPV分别为HPV16和HPV18，在99%宫颈病变中均检测出HPV16或HPV18[1]。环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)信号通路是G蛋白偶联的细胞信号传导途径，在多项细胞生理过程中发挥作用[2]。蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)是cAMP的主要效应分子，可以使多种细胞质与细胞核内蛋白磷酸化[3]。有研究表明cAMP/PKA参与细胞增殖、分化及凋亡过程，与VEGF的表达密切相关。现为了探究cAMP/PKA通路在HPV16/18相关宫颈癌中的表达情况及临床意义，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取于我院2018年6月至2021年6月收治的86例宫颈癌患者作为研究组，取同期患有妇科其他良性病变行宫颈切除手术患者75例作为对照组。纳入标准：①符合《2016年NCCN宫颈癌临床实践指南》[4]中的诊断标准；②均行手术治疗；③临床资料完整；④自愿参与本研究。排除标准：①术前行放化疗或免疫治疗；②严重肝肾功能不全；③严重自身免疫性疾病。研究组患者年龄33～65岁，平均年龄(46.23±12.62)岁。病理类型：鳞癌53例，腺癌33例。临床分期：ⅠA期9例，ⅠB期15例，ⅡA期27例，ⅡB期18例，Ⅲ期17例。病理结果：高分化18例，中分化32例，低分化36例。对照组患者年龄34～68岁，平均年龄(47.22±11.38)岁。两组研究对象性别、年龄等资料无统计学差异，具有可比性(P>0.05)。本研究经医院医学伦理委员会同意。

1.2 方法

细胞培养及PKA检测：将研究组患者术后切除的宫颈病变组织进行收集，同时收集对照组患者术后切取的宫颈组织标本于液氮中保存。将宫颈癌HeLa细胞(上海派通生物科技有限公司)置于含有10%胎牛血素和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基(美国Sigma公司)，于37 ℃、5% CO2和饱和湿度的培养箱中培养。将培养的HeLa细胞铺于培养皿中，添加500 μmol/L的cAMP/PKA信号激动剂db-cAMP，静置2 h后检测PKA活性。

1.3 观察指标

对两组研究对象组织标本中的cAMP/PKA通路的表达水平进行比较，其中阳性判定以细胞质内出现棕色颗粒为阳性，分为阴性、阳性。阴性：标本未见阳性细胞；阳性：标本可见阳性细胞。

对cAMP/PKA阳性组与阴性组标本进行HPV检测，采用PCR扩增及膜杂交法。根据医用核酸分子快速杂交法试剂盒的用法，对组织标本进行DNA提取、PCR扩增、杂交、洗膜及显色结果。

对cAMP/PKA阳性组与阴性组进行免疫组化法检测血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)表达水平情况。

采用Spearman相关性分析，对cAMP/PKA通路表达与VEGF表达及宫颈癌HPV16/18感染情况进行相关性分析。

1.4 统计学方法

应用SPSS 20.0进行统计分析。计数资料以“%”表示，采用χ2检验进行组间比较，采用Spearman相关分析cAMP/PKA通路表达与VEGF表达水平及宫颈癌HPV16/18感染情况的相关性，记P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 两组标本中cAMP/PKA通路的表达水平比较

研究组cAMP/PKA的表达水平呈阴性表达有8例(9.30%)，阳性表达78例(90.70%)，cAMP/PKA通路阳性率为90.70%。对照组中其阴性表达为70例(93.33%)，阳性表达为5例(6.67%)。研究组标本中cAMP/PKA通路阳性率明显高于对照组(P<0.05)。

2.2 cAMP/PKA阳性组与阴性组中HPV16/18感染情况比较

78例cAMP/PKA阳性表达的宫颈病变组织中，感染HPV16 34例(43.59%)，感染HPV18 39例(50.00%)，HPV16/18总阳性率为93.59%。8例cAMP/PKA阴性表达的宫颈病变组织中，感染HPV16 2例(25.00%)，感染HPV18 2例(25.00%)，HPV16/18总阳性率为50.00%。cAMP/PKA通路阳性组中HPV16/18阳性率明显高于阴性组(P<0.05)。见表1。

表1 cAMP/PKA阳性组与阴性组中HPV16/18感染阳性率比较(例，%)

2.3 cAMP/PKA阳性组与阴性组中血管内皮生长因子的表达情况

cAMP/PKA通路阳性组中，VEGF表达水平呈阴性表达8例(10.26%)，阳性表达70例(89.74%)；阳性率为89.74%；在阴性组中VEGF阴性表达5例(62.50%)，阳性表达3例(37.50%)，阳性率为37.50%。cAMP/PKA通路阳性组中VEGF阳性率明显高于阴性组(P<0.05)。

2.4 Spearman相关性分析

经Spearman相关性分析可知，cAMP/PKA通路与VEGF表达水平呈正相关性(P<0.05)，cAMP/PKA通路表达水平越高，VEGF的表达水平越高。cAMP/PKA通路与宫颈癌HPV16/18感染情况呈正相关性(P<0.05)，cAMP/PKA通路表达水平越高，患者感染HPV16/18的概率越大。见表2。

表2 cAMP/PKA通路与VEGF表达及宫颈癌HPV16/18感染情况相关性分析

3 讨论

宫颈癌以鳞癌为主要病理类型，且呈逐渐年轻化的趋势，HPV感染是公认的导致宫颈癌的主要因素[5]。HPV是一种DNA病毒，存在于人体各个部位，由于基因型的不同，HPV有100多种分型。经过研究发现，HPV16、18、33等分型更易引起宫颈病变，高危型HPV16/18是目前临床最为关注的分型[6]。近年来，临床治疗宫颈癌的主要方式有手术、放射及化学治疗，但仍不能提高患者的生存率[7]。手术治疗宫颈癌是主要的临床手段，对病灶组织进行切除，减慢病情发展，但宫颈癌早期发病时缺乏典型的临床症状，因此大多患者在确诊时已为中、晚期[8]。有研究表明，患者在治疗宫颈癌的过程之中存在复发及远处转移，其发生的原因主要可能是肿瘤细胞的免疫逃逸，这是肿瘤发生及发展的一个重要机制[9]。在免疫系统中，cAMP/PKA信号通路主要在固有免疫和获得性免疫相互调节的过程中发挥作用，通过结合不同的胞外和胞内信号分子从而发挥调节功能[10]。cAMP/PKA通路是经典的细胞信号传导通路，由G蛋白偶联受体作为介导[11]。当外界信号分子对膜体进行刺激时，细胞内腺苷酸环化酶被激活，从而细胞内的cAMP表达水平上升，cAMP再激活PKA，PKA表达水平升高产生一系列的生物学反应[12]。已有研究证实，cAMP/PKA在基因转录、新陈代谢、细胞增殖、凋亡等过程中均有参与。PKA是cAMP的下游分子，其构成是催化亚基和调节亚基，催化亚基可作为多种底物磷酸化的介导，调节亚基存在两种亚型RⅠ和RⅡ，主要参与细胞增殖及分化的过程[13]。当外界因素刺激细胞内RⅠ型亚基高水平表达，引起细胞无限增殖，最后形成肿瘤[14]。当cAMP/PKA信号通路被激活时，可调控宫颈癌细胞的免疫逃逸，促进宫颈癌的发展，导致宫颈癌细胞侵袭性生长，患者发病致死率升高，因此深入研究宫颈癌的发展及及免疫逃逸机制可有效提高患者的生存率[15]。

肿瘤发生侵袭转移有两种重要途径，一是血管生成，二是上皮间质的转化，而VEGF是诱导血管生成的重要因子之一，参与肿瘤血管生成及转移的过程[16]。目前已有研究表明VEGF与cAMP/PKA信号通路的激活也存在密切关系，激活cAMP/PKA信号通路，能够促进血管内皮细胞分泌VEGF，促进肿瘤新生血管的生成[17]。

在本研究中，通过检测两组研究对象cAMP/PKA通路的表达水平，可得研究组cAMP/PKA表达水平阴性表达为8例，对照组为70例；研究组阳性表达为78例，对照组为5例；研究组cAMP/PKA通路阳性率为90.70%，对照组为6.67%。研究组cAMP/PKA通路的阳性率明显高于对照组，说明在宫颈癌组织细胞中，cAMP/PKA信号通路被激活，高于正常组织中的表达水平。对cAMP/PKA通路阳性组和阴性组的HPV16/18感染情况进行比较，发现在cAMP/PKA通路阳性组中，感染HPV16为34例，阴性组为2例；阳性组中感染HPV18为39例，阴性组为2例。cAMP/PKA通路阳性组中HPV16/18总阳性率为93.59%，阴性组为50%，阳性组感染HPV16/18的几率明显大于阴性组。说明宫颈癌细胞中cAMP/PKA通路的表达水平升高，宫颈癌组织细胞的免疫逃逸被调控，患者机体免疫能力下降，所以感染HPV16/18的概率也增大。本研究还比较了cAMP/PKA通路阳性组与阴性组的VEGF表达水平，得到在阳性组中，VEGF阳性表达为70例，阴性组为3例；VEGF阴性表达阳性组为8例，阴性组为5例。由此可得，cAMP/PKA通路阳性表达可以促进宫颈癌组织中VEGF的表达水平提高。经过Spearman相关性分析，得到cAMP/PKA通路与VEGF表达水平呈正相关，当cAMP/PKA信号通路被激活时，宫颈癌组织中的VEGF表达水平也会升高；同时cAMP/PKA通路与宫颈癌HPV16/18感染也呈正相关，在宫颈癌组织中cAMP/PKA的表达水平越高，则患者感染HPV16/18的可能性越大。

综上所述，宫颈癌组织中cAMP/PKA通路表达水平高于正常组织，cAMP/PKA通路的表达与VEGF表达水平及患者感染HPV16/18 呈正相关性，cAMP/PKA通路的表达水平升高，可以促进VEGF的表达，同时患者感染HPV16/18的风险也升高。