康艾注射液体外对乳腺癌MCF7细胞凋亡的影响

颜 伟 王雅琦 陈潭琇

乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，占女性恶性肿瘤的三分之一，每年约有150万女性被确证为乳腺癌，具有高度侵袭、转移和复发的特点[1]。我国乳腺癌发病率相对较低，但近年来发病率呈显著上升趋势，尤其是在上海、北京、天津及其他大城市[2]。据估计，乳腺癌在未来几十年将成为我国女性发病率最高，对女性健康威胁最大的恶性肿瘤。因此，我们亟待寻找治疗乳腺癌更为有效的方法[3]。近年来，随着中药应用的不断推广，众多研究人员将关注点转向抑制恶性肿瘤细胞生长的中药研究，在研究工作当中人们发现康艾注射液是一种抗肿瘤中药制剂，其副作用较小，可作为辅助药物治疗多种肿瘤，具有独特的优势[4]。本研究以乳腺癌细胞系MCF7细胞为研究对象，研究康艾注射液在体外对其凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞

乳腺癌细胞系 MCF7购自美国模式培养物集存库(ATCC)。

1.2 试剂

DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶以及EDTA均购自美国 Gibco公司；FITC-Annexin V/PI试剂盒购自联科生物公司；Caspase 3 抗体(1∶1000；#9661；Cell Signaling Technology，Inc.)PARP抗体(1∶1000； #9542；Cell Signaling Technology，Inc.)；β-actin抗体(1∶4000，A5316，Sigma)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组 将细胞分3组，分别用0 mM、20 mM、40 mM康艾注射液处理48 h。

1.3.2 Annexin-V/PI法检测细胞凋亡 收集经康艾注射液处理过的细胞，3000×g室温离心5 min。弃上清，加入500 μl 1× binding buffer重悬细胞，加入5 μl FITC标记Annexin V和10 μl PI室温避光孵育5 min。样品用流式细胞仪进行检测。

1.3.3 Western Blot 用细胞裂解液(1% Triton X-100；10 mM Tris-HCl，pH 7.4；150 mM NaCl； 0.25% sodium desoxycholate；5 mM EDTA，PH 7.4)裂解细胞，获总蛋白。各组取15 μg总蛋白，采用10% SDS-PAGE电泳，转PVDF膜(Millipore，Bedford)，封闭液封闭1 h后，用一抗4 ℃过于孵育过夜，TBS-T清洗3次，用HRP标记二抗室温孵育1 h。化学发光显影成像(Pierce，Rockford，IL，USA)。

1.4 统计学方法

应用SPSS软件进行统计处理，两组之间计量资料采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 康艾注射液促进乳腺癌MCF7细胞凋亡

采用Annexin-V/PI法检测康艾注射液对乳腺癌MCF7细胞凋亡的影响。乳腺癌MCF7细胞经康艾注射液干预48 h后，细胞凋亡率明显增高，且40 mM康艾注射液处理组凋亡率高于20 mM康艾注射液处理组凋亡率，差异具有统计学意义(P<0.05)。由此提示康艾注射液可促进乳腺癌MCF7细胞凋亡，见图1。

图1 康艾注射液对乳腺癌MCF7细胞凋亡的影响

2.2 康艾注射液通过调节凋亡相关蛋白表达促进凋亡

采用Western Blot检测了康艾注射液对凋亡相关蛋白Caspase和PARP表达的影响。结果显示，MCF7细胞经康艾注射液处理后cl-Caspase和cl-PARP表达水平增高，且40 mM康艾注射液处理组的表达水平高于20 mM康艾注射液处理组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 康艾注射液对乳腺癌MCF7细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

3 讨论

随着经济的增长和生活水平的提高，我国乳腺癌的发病率和死亡率均呈上升趋势。目前，临床上乳腺癌的治疗主要采用手术、化疗、激素治疗以及放疗等方式，这些治疗方式对乳腺癌具有较好疗效，但也存在一些副作用，比如白细胞降低、呕吐、剧烈疼痛等。我们知道部分传统中药具有抗肿瘤作用且副作用小，另外，传统中药抗肿瘤作用方式不是通过作用于单一靶点发挥功能，它们可能兼具增强免疫功能、下调VEGF表达、调控凋亡相关基因表达、逆转肿瘤发生药物耐受或者直接杀伤肿瘤的功能[5]。传统中药制剂康艾注射液，其主要成分为人参、黄芪和苦参素，临床上作为化疗辅助用药应用较广，目前已有研究报道康艾注射液在抗肿瘤、促进骨髓造血、提高机体免疫力及改善患者生存质量等方面具有确切的作用。陈日等人用康艾注射液处理肝癌细胞后，肝癌细胞的增殖能力减弱，G0/G1期和G2/M期细胞均减少，凋亡率增加，并且这种效应随康艾注射液浓度的升高而增强[6]。体外研究表明康艾注射液能够抑制人类乳腺癌细胞增殖，抑制克隆形成，诱导凋亡，Western Blot结果显示其可能是通过影响AMPK/mTOR信号传导通路促进乳腺癌细胞凋亡[7]。蒋益兰等报道康艾注射液可有效改善老年晚期消化系统肿瘤患者的临床症状、提高生活质量且具有较高的安全性[8]。另外，康艾注射液被报道还能够用于治疗结直肠癌、肺癌、肝癌及淋巴瘤化疗引起的白细胞减少症。有报道显示脾气亏虚型老年结直肠癌术后xelox方案辅助化疗患者在应用康艾注射液后，患者主观及客观生活质量有所提高(KPS评分和QLQ-C30评分较对照组提高)，具有促白细胞和血红蛋白的作用，同时可减轻化疗所致骨髓抑制、消化道反应和神经系统反应[9]。

本研究以中医药理论为指导，旨在探讨康艾注射液对乳腺癌MCF细胞凋亡的影响。实验结果发现与对照组相比，康艾注射液处理后的MCF细胞凋亡率明显升高，且40 mM剂量组细胞凋亡率高于20 mM剂量组，差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组相比，MCF细胞在经过康艾注射液处理后cl-Caspase3 和cl-PARP表达水平明显升高，且40 mM剂量组细胞凋亡率高于20 mM剂量组(P<0.05)。综上所述，体外实验显示康艾注射液具有诱导乳腺癌MCF7细胞凋亡的功能，其主要通过促进凋亡相关蛋白cl-Caspase3 和cl-PARP的表达实现。本研究结果说明康艾注射液在乳腺癌治疗方面具有一定的效果，为乳腺癌临床治疗方案选择提供一定的指导意义。