多聚长效抗菌膜液材（敷）料裂解细菌生物膜的作用研究

田爽，倪朝辉，赵雪利，胡治，罗建良，宋柏杉，杨欣，黄红兰

细菌黏附材料表面并形成生物膜，可造成植入物的失败或患者感染。目前，多釆用添加传统抗菌剂来制备抗菌材料，例如，抗生素、金属及其盐、季铵盐化合物、聚六亚甲基双胍等，而这些方法存在一定的弊端。比如浸出的抗生素和重金属，被掺入到聚合物表面逐渐释放，增加微生物对抗菌剂的耐受性；次致死剂量的抗生素加剧生物膜的形成；生物大分子和死亡微生物聚集在聚合物表面，阻止抗菌功能团发挥作用等。因此，需要寻找一种新型的抗菌材料或抗菌改性方法。

多聚长效抗菌膜液材（敷）料是一种新型复方生物材料，是通过多元接枝改性技术合成的第七代季铵盐聚合物产品。区别于临床现有的一过性杀菌产品，通过生物工程的接枝改性技术，对原有各成分的化学结构进行了修饰，各组分通过多次的基团替换和关联嫁接，改变了原有各成分的属性和关系，优化了分子结构，使其具有长效抗菌的能力，很好地阻断创面病原微生物的侵袭与定植，用于皮肤及黏膜创面感染的预防和辅助治疗，促进创面愈合[1]。

细菌的生物膜是一些细菌附着并包埋于创面，与细胞外基质等形成的一种膜性结构，是创面难愈或不愈的一种新机制[2]。本研究观察了多聚长效抗菌膜液材（敷）料对临床分离的鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、大肠埃希菌、白念珠菌形成的生物膜的裂解作用，为临床治疗细菌生物膜感染提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药物 由太信太德生物医学工程（湖南）有限公司生产的多聚长效抗菌膜液材（敷）料，商品名：捷克信；产品批号：202104271-1。银离子抑菌剂（生产批号：20122113）和碘伏（生产批号：200621）作为阳性对照药物，购自长春希凯科技发展有限公司。

1.1.2 试验菌株 鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、大肠埃希菌、白念珠菌均自临床标本中分离，由吉林大学基础医学院病原生物学实验室保存。

1.1.3 仪器设备 SW-CJ-1F 型净化工作台购自苏州净化设备有限公司；YA28X-4T/10JL 高压蒸汽灭菌器购自上海博讯实业有限公司；DHP060 型电热恒温培养箱购自上海实验仪器厂有限公司；PC5515R 台式高速离心机和 AX223ZH 型分析天平购自奥豪斯仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化 将金黄色葡萄球菌、MRSA、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、白念珠菌、金黄色葡萄球菌 + 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌 + 铜绿假单胞菌，接种于肉汤培养基中，置于 37 ℃ 恒温振荡培养箱中，160 r/min 4 h，使细菌浓度达到 9 × 108CFU/ml[3]。

1.2.2 最小抑菌浓度（MIC）测定 采用倍比稀释法测定捷克信、碘伏、银离子的 MIC[4]。无细菌生长的药物最高稀释度为最小抑菌浓度（MIC）。

1.2.3 细菌生物膜形成周期测定 将稀释后的菌液加入到放有细胞爬片的 6 孔板中，37 ℃ 培养，每 24 小时换液一次。通过结晶紫染色测定 12、24、36、48 h 每种菌生物膜的形成情况[5]。

1.2.4 裂解细菌生物膜试验 将稀释后的菌液加入到放有细胞爬片的 6 孔板中。肺炎克雷伯菌37 ℃ 恒温培养箱中连续培养 48 h，其余菌连续培养 24 h。在已形成生物膜的 6 孔板中加入 2 ×MIC 浓度的碘伏、捷克信、银离子，37 ℃ 培养8 h。通过结晶紫染色以及活菌计数观察碘伏、捷克信、银离子裂解已形成的生物膜的能力[5]。

2 结果

2.1 多聚长效抗菌膜液材（敷）料对细菌的最小抑菌浓度

采用倍比稀释法测定多聚长效抗菌膜液材（敷）料对临床分离的金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、白念珠菌以及金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌混合液、金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌混合液的 MIC，银离子与碘伏作为阳性对照，如表1 所示。

表1 多聚长效抗菌膜液材（敷）料对细菌的最小抑菌浓度（MIC）（mg/L）Table 1 The MIC of JEK SUNG against bacteria (mg/L)

2.2 细菌生物膜形成周期测定

细菌在六孔板上形成生物膜的情况如图1 所示，金黄色葡萄球菌、MRSA、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、白念珠菌、金黄色葡萄球菌 + 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌 + 铜绿假单胞菌的生物膜在 24 h 时形成的形态最好，肺炎克雷伯菌的生物膜在 48 h 时形成的形态最好。

2.3 裂解细菌生物膜结果

2.3.1 结晶紫染色观察 向已培养的生物膜样品中加入 2 × MIC 浓度的碘伏、捷克信、银离子，37 ℃ 培养 8 h。结晶紫染色显示，捷克信可以有效裂解已形成的生物膜（图1）。对金黄色葡萄球菌、MRSA、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌 + 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌 + 铜绿假单胞菌形成的生物膜裂解效果较明显。

图1 捷克信裂解细菌生物膜Figure 1 JEK SUNG lytic bacterial biofilm

2.3.2 活菌计数观察 将细胞爬片洗脱的菌液做倍比稀释后，涂布于 NA 固体平板上，37 ℃ 培养18 ～ 20 h，取菌落数为 30 ～ 300 之间的平板计算活菌数。结果如图2 所示，捷克信可以有效裂解生物膜中的细菌，其中裂解金黄色葡萄球菌、MRSA、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌 + 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌 + 铜绿假单胞菌的效果显著，与细菌对照组比较，差异显著。

图2 捷克信裂解细菌生物膜（活菌计数）Figure 2 JEK SUNG lytic bacterial biofilm (viable count)

3 讨论

多聚长效抗菌膜液材（敷）料是一种新型复方生物材料，是通过多元接枝改性技术对原有各成分的化学结构进行修饰，优化了分子结构，起到了多组分聚合协同增效的作用，从而全面提升了产品的临床疗效[6]。

前期研究显示，多聚长效抗菌膜液材（敷）料对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌有抑制作用[1]。在此基础上，本研究探讨了多聚长效抗菌膜液材（敷）料裂解细菌生物膜的作用。

通过形态学和生物膜内活菌计数显示，多聚长效抗菌膜液材（敷）料对金黄色葡萄球菌、MRSA、大肠埃希菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌与大肠埃希菌混合感染以及金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌混合感染形成的生物膜裂解效果较明显。其中，对金黄色葡萄球菌、MRSA 以及金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌混合感染形成的生物膜裂解效果，与阳性对照药物银离子比较，差异显著。

多聚长效抗菌膜液材（敷）料中，有机硅季铵盐以化学键方式附着和固定在组织的表面，通过有机硅的接枝聚合形成交联膜，改变细菌胞壁的通透性，使菌体内的酶、辅酶和代谢中间产物溢出，致使微生物发生“接触死亡”；聚季铵盐-1 破坏细菌细胞膜，导致细胞内容物渗出；壳聚糖季铵盐破坏细菌细胞壁的结构和功能，改变菌体的 pH 环境[7]，从而杀死生物膜中的细菌。

多聚长效抗菌膜液材（敷）料在体外实验中裂解细菌生物膜的形成，为临床上使用细菌生物膜感染的防治提供了理论依据。