1.5GHz微波辐射对大鼠外周血免疫细胞和脾脏组织影响的量效关系研究

董霁，姚传福，管淑婷，王惠，王浩宇，张静，徐新萍，姚斌伟，周红梅，赵黎，彭瑞云

近年来，随着技术的不断进步和突破，微波已被广泛应用于通讯、医疗、化学合成、消毒等诸多领域。但同时，也使得大量的职业人群和非职业人群更多地暴露于微波辐射环境中，因此，人们对于微波辐射造成的潜在健康风险的担忧也日益增加[1-3]。大量研究报道提示，微波辐射可通过热和非热效应损伤机体多个系统[4-8]。L 波段微波（1.0 ～2.0 GHz）被广泛应用于无线电通讯中，但其对机体影响的研究缺乏。

免疫系统是机体抵御外源刺激的第一道防线，在维持机体稳态中具有至关重要的作用。研究表明，免疫细胞是电离辐射和非电离辐射的敏感靶细胞[5]。相对于电离辐射，非电离辐射对免疫细胞的影响仍然存在很大的争议[9-12]。因此，本研究采用1.5 GHz 微波辐射大鼠，探讨不同功率密度条件下，大鼠免疫组织和相关细胞的变化，明确免疫系统损伤的特征和量效关系，为微波辐射致免疫系统损伤的诊断和防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 石蜡购自德国 Leica 公司；二甲苯、高锰酸钾、升汞甲醛、脱钙液等购自国药集团；中性树胶、苏木素染色液、伊红染色液等购自北京中杉金桥生物技术公司；藻红蛋白（phycoerythrin，PE）小鼠抗大鼠 CD45 抗体、别藻蓝蛋白（allophycocyanin，APC）小鼠抗大鼠 CD3 抗体、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）小鼠抗大鼠 CD45R 抗体、PE 小鼠抗大鼠 CD45抗体、APC 小鼠抗大鼠 CD3 抗体、FITC 小鼠抗大鼠 CD161a 抗体、APC 小鼠抗大鼠 CD3 抗体、FITC 小鼠抗大鼠 CD4 抗体、PE 小鼠抗大鼠CD8a 抗体等购自 Biolegend 公司（中国）。Cytokine&Chemokine 22-Plex Rat ProcartaPlex Panel购自美国 Thermo Fisher 公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.2 仪器设备 高速离心机为德国 Eppendorf公司产品；水平低速离心机为 Monad 公司产品；全自动脱水机、石蜡包埋机、石蜡切片机、烤片机和光学显微镜为德国 Leica 公司产品；透射电子显微镜为日本 Hitachi 公司产品；全自动血细胞分析仪为日本 Sysmex 公司产品；流式细胞仪为美国BD 公司产品；多功能液相芯片分析平台为美国Luminex 公司产品。

1.2 方法

1.2.1 实验动物及分组 80 只二级雄性 Wistar大鼠，体重（180 ± 20）g，购自维通利华，合格证号 SCXK（京）2016-0006，饲养于本院实验动物中心。根据微波辐射平均功率密度随机分为 4 组，分别为：假辐射组（Sham 组），5 mW/cm2微波辐射组（L5），30 mW/cm2微波辐射组（L30）和50 mW/cm2微波辐射组（L50），每组 20 只大鼠。

1.2.2 微波辐射 采用本院微波辐射系统[13-14]，大鼠置于有机玻璃圆盘中，辐射台匀速旋转以确保全身均匀辐射。微波辐射频率为 1.5 GHz、平均功率密度分别为 5、30 和 50 mW/cm2，辐射时间为6 min。假辐射组处理方法同微波辐射组，但不予微波暴露。

1.2.3 大鼠外周血细胞分析 分别于辐射后 6 h、7 d 和 14 d，采用 1% 戊巴比妥钠（30 mg/kg）经腹腔注射麻醉，经腹主静脉取血 0.5 ml，置于肝素抗凝管中，采用全自动血细胞分析仪检测外周血中白细胞（white blood cell，WBC）、淋巴细胞、中性粒细胞的数目。

1.2.4 大鼠外周血淋巴细胞亚群分析 按照上述方法收集抗凝外周血，取 100 ～ 200 μl 置于流式检测管中，按照下述模块加入相应的抗体各 1.0 μl。模块 1：T 淋巴细胞和 B 细胞淋巴比例（PE 抗大鼠 CD45 抗体、APC 抗大鼠 CD3 抗体、FITC抗大鼠 CD45R 抗体）；模块 2：NK 细胞比例（PE 抗大鼠 CD45 抗体、APC 抗大鼠 CD3 抗体、FITC 抗大鼠 CD161a 抗体）；模块 3：T 淋巴细胞亚型（APC 抗大鼠 CD3 抗体、FITC 抗大鼠 CD4 抗体、PE 抗大鼠 CD8a 抗体）。经流式细胞仪检测各细胞亚群百分比。

1.2.5 大鼠外周血清细胞因子浓度检测 按照上述方法收集外周血（不抗凝），分离血清，采用Cytokine&Chemokine 22-Plex Rat ProcartaPlex Panel，于多功能液相芯片分析平台检测多种免疫细胞因子，包括 IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A 和 TNF-α 等浓度。

1.2.6 大鼠脾脏和骨髓组织结构观察

1.2.6.1 光镜观察 于微波辐射后 6 h、7 d 和14 d，分离大鼠脾脏组织和胸段椎骨。将脾脏组织置于 10% 福尔马林溶液固定 3 周后，进行病理制片和苏木精-伊红（HE）染色。将胸段椎骨采用Helly 液固定 24 h 后，置于 10% 福尔马林溶液固定 3 周，取材后在脱钙液中浸泡 3 周，待骨组织软化透明，进行病理制片和 HE 染色。组织切片在光学显微镜下观察并拍照。

1.2.6.2 电镜观察 取微波辐射后 7 d 的脾脏组织 1 mm2，置于 2.5% 戊二醛磷酸缓冲固定液中固定过夜，0.1 mol/L 磷酸缓冲液冲洗后，采用 1%锇酸固定并用双蒸水冲洗。经梯度乙醇脱水，丙酮和包埋液浸透包埋后，制作半薄切片和 HE 染色，采用光学显微镜定位组织，并制作超薄切片。经醋酸铀和硝酸铅负染后，在透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）下观察并拍照。

1.3 统计学处理

文中的数据均以±s表示，统计分析采用GraphPad Prism 6.0 软件，采用两因素多水平方差分析进行整体分析，采用t检验进行两两比较分析。

2 结果

2.1 1.5 GHz 微波辐射减少大鼠外周血中免疫相关细胞的数量

为了明确微波辐射后外周血免疫细胞的波动，首先分析了辐射后外周血中免疫相关细胞的数量。结果发现，1.5 GHz 微波辐射可在辐射后 6 h 和7 d 减少 WBC 和淋巴细胞的数量（P＜ 0.05），辐射后 14 d 恢复（图1A 和图1B）。但是，微波辐射对大鼠外周血中性粒细胞的数量无显著影响（图1C）。进一步分析发现，辐射后 6 h 和7 d，L5 和 L50 组，WBC 和淋巴细胞的数量略低于L30 组。上述结果表明，不同平均功率密度的微波辐射对外周血免疫相关细胞数量影响不一，可能是辐射损伤及机体自我修复机制共同作用的结果。

图1 1.5 GHz 微波辐射后大鼠外周血免疫相关细胞数量变化（A：白细胞；B：淋巴细胞；C：中性粒细胞；与 Sham 组相比，*P ＜ 0.05，***P ＜ 0.001）Figure 1 The alterations of immune cells in peripheral blood after 1.5 GHz microwave exposure (A: White blood cells; B:Lymphocytes; C: Neutrophils; *P ＜ 0.05, ***P ＜ 0.001 vs Sham)

2.2 1.5 GHz 微波辐射动态调节大鼠外周血淋巴细胞亚群

由于外周血淋巴细胞对于微波辐射的敏感性，分析了不同亚群淋巴细胞的动态变化规律，包括 B淋巴细胞、T 淋巴细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK）等。辐射后 6 h、7 d 和 14 d 的流式细胞仪检测结果显示，5 mW/cm2微波辐射对B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞的比例无显著影响，而30 和 50 mW/cm2微波辐射可显著提升 B 淋巴细胞的比例，并下调 T 淋巴细胞的比例。同时，微波辐射对 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞的调节作用与平均功率密度相关（图2A ～ B）。与 Sham 组相比，各辐射组 NK 细胞于辐射后 6 h 显著上调（P＜ 0.001）（图2C）。此外，还进一步分析了 T 淋巴细胞亚群，包括 CD4+T 淋巴细胞和 CD8+T 淋巴细胞的变化，结果显示，微波辐射对 T 淋巴细胞亚群并无显著影响（图3D）。上述结果提示，1.5 GHz 微波辐射后，机体 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞亚群呈现剂量依赖性的调节，以维持机体免疫平衡。

图2 1.5 GHz 微波辐射后大鼠外周血淋巴细胞亚群的变化（A：B 淋巴细胞；B：T 淋巴细胞；C：NK 细胞；D：CD4+T与 CD8+T 的比值；与 Sham 组相比，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；与 L5 组相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001）Figure 2 The subtypes of lymphocytes in peripheral blood after 1.5 GHz microwave exposure (A: B lymphocytes; B: T lymphocytes; C: NK cells; D: The ratio of CD4+ T lymphocytes to CD8+ T lymphocytes; ** P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001 vs Sham; #P ＜ 0.05,##P ＜ 0.01, ###P ＜ 0.001 vs L5)

2.3 1.5 GHz 微波辐射促进多种细胞因子的表达

细胞因子在促进淋巴细胞和多种免疫细胞增殖、分化和活化过程中发挥重要作用。因此，本研究分析了与 B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞增殖和活性密切相关的细胞因子，包括 IL-2、IL-4、IL-6、IL-17A 和 TNF-α 的含量变化。结果发现，辐射后6 h 和 7 d，5 mW/cm2微波辐射后细胞因子无显著改变，而 30 mW/cm2和 50 mW/cm2微波辐射后细胞因子表达显著上调（P＜ 0.05）。其中，辐射后6 h，50 mW/cm2微波辐射对细胞因子的上调作用强于 30 mW/cm2微波辐射；但辐射后 7 d，两组之间无显著差异（图3）。上述结果与外周血中B 淋巴细胞和 T 淋巴细胞的动态变化规律一致，表明 30 mW/cm2和 50 mW/cm2微波辐射后，机体通过动态调节机体的免疫平衡，可以达到修复免疫系统损伤的目的。

图3 1.5 GHz 微波辐射后大鼠血清细胞因子水平变化（A：IL-2；B：TNF-α；C：IL-4；D：IL-6；E：IL-17A；与 Sham 组相比，*P ＜ 0.05，**P ＜ 0.01，***P ＜ 0.001；与 L5 组相比，#P ＜ 0.05，##P ＜ 0.01，###P ＜ 0.001；与 L30 组相比，$$P ＜ 0.01，$$$P ＜ 0.001）Figure 3 The secretion of cytokines in serum after 1.5 GHz microwave exposure (A: IL-2; B: TNF-α; C: IL-4; D: IL-6; E: IL-17A;*P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01, ***P ＜ 0.001 vs Sham; # P ＜ 0.05, ## P ＜ 0.01, ### P ＜ 0.001 vs L5; $$P ＜ 0.01, $$$P ＜ 0.001 vs L30)

2.4 1.5 GHz 微波辐射剂量依赖地损伤大鼠脾脏组织

平均功率密度为 5、30 和 50 mW/cm2的1.5 GHz 微波辐射大鼠后，采用光镜观察脾脏和骨髓的组织结构。结果显示，微波辐射可引起脾脏组织损伤，辐射后 6 h 损伤出现，以辐射后 7 d 损伤最重，辐射后 14 d 呈恢复趋势。以辐射后 7 d为例，Sham 组脾脏组织脾小体完整，细胞增殖旺盛，而各辐射组则出现不同程度的血管淤血、淋巴细胞核碎裂等改变，且随着平均功率密度的增加，组织损伤呈现加重趋势。但微波辐射对骨髓组织结构无显著影响，表现为骨髓结构完整、骨小梁排列整齐，血细胞丰富（图4A ～ B）。

图4 1.5 GHz 微波辐射后 7 d 大鼠脾脏和骨髓组织结构、脾脏超微结构变化[A：骨髓组织结构（Scale bar = 50 μm）；B：脾脏（Scale bar = 50 μm）；C：脾脏组织超微结构（Scale bar = 500 nm）]Figure 4 The histopathological analysis of rats′ spleen and bone marrow at 7 d after 1.5 GHz microwave exposure [A: Bone marrow (Scale bar = 50 μm); B: Spleen (Scale bar = 50 μm); C: The ultrastructure analysis of spleen (Scale bar = 500 nm)]

进而，通过 TEM 观察脾脏组织超微结构，结果显示，Sham 组脾脏组织淋巴细胞胞核、线粒体和粗面内质网等结构完整，L5 组可见线粒体肿胀、嵴断裂，粗面内质网肿胀，L30 组可见线粒体肿胀、嵴断裂、甚至消失，L50 组可见线粒体空化明显，同时胞浆胞核凝固、溶酶体增多等（图4C）。上述结果提示，微波辐射可剂量依赖地损伤脾脏组织。

3 讨论

微波技术已经被广泛应用于人们的日常生活中，微波辐射引起的健康危害越来越受到关注[12-21]。既往研究主要以神经系统、心血管系统和生殖系统等为重点，揭示了不同波段微波的损伤效应[22-24]。由于免疫系统是机体抵抗外源危险信号的第一道防线，能快速启动反应，因此对于免疫系统损伤效应也逐步开展，主要以 S 波段微波辐射大小鼠，明确了其对外周血细胞的影响，同时发现微波辐射可显著降低 NK-92 细胞的杀伤活性并诱导其凋亡[25]。但目前，微波辐射对免疫损伤效应的研究仍然较少，且研究结果存在争议[9-12]。

L 波段微波是通讯系统中常见的微波频段，其对机体的影响研究缺乏。本课题组前期已经成功建立了 1.5 GHz 微波辐射损伤动物模型，发现了其可损伤大鼠学习记忆和工作记忆，并明确致伤机制[23,26]。但 L 波段微波对免疫系统的研究未见报道。此外，我们前期研究了不同功率密度 S 波段微波的生物学效应，发现平均功率大于 5 mW/cm2的微波辐射可造成明显的损伤效应[14]。因此，本研究以 5、30 和 50 mW/cm2等不同平均功率密度的1.5 GHz 微波辐射大鼠，发现该辐射损伤模型未引起大鼠体温的变化（数据未显示），表明该条件下存在非热效应。1.5 GHz 微波辐射可造成大鼠外周血 WBC 和淋巴细胞数量下降，于辐射后 7 d减少最为明显，于辐射后 14 d 恢复，表明微波辐射可造成免疫相关细胞可逆性损伤；大鼠脾脏组织损伤，且于辐射后 7 d 损伤最重，而后逐步恢复，表明微波辐射可损伤机体免疫器官。此外，30 和50 mW/cm2微波辐射刺激下，可剂量依赖地上调B 淋巴细胞比例和下调 T 淋巴细胞比例，并通过调节细胞因子含量，以稳定机体免疫平衡，促进免疫修复。因此，上述结果提示 1.5 GHz 微波辐射可导致机体免疫损伤效应，且不同功率密度下的机体损伤修复机制不同。

综上所述，1.5 GHz 微波辐射可致大鼠外周血WBC 和淋巴细胞数量下降，B 淋巴细胞比例上调、T 淋巴细胞比例下调，B 和 T 淋巴细胞增殖与活化相关细胞因子的含量增加；脾脏组织损伤。同时，脾脏组织损伤程度、淋巴细胞比例改变和细胞因子分泌变化等，与微波辐射平均功率密度呈正相关。