血清TLR4 水平与肺癌化疗后骨髓抑制的 相关性分析

刘梦瑶 罗莲 陈梓林 颜磊 周娜 陈勇

肺癌是发生于肺部的恶性肿瘤,其发病率与病死率近年来均排在我国恶性肿瘤的第1 位。多数患者出现症状时已经到了晚期,失去最佳治疗的时机。以铂类为基础的联合用药依旧是当下治疗非小细胞肺癌患者的主要方案［1,2］。骨髓抑制是临床上化疗最常见的剂量限制副反应。化疗会消耗大量的骨髓祖细胞,出现骨髓纤维化、抑制成熟血细胞释放、骨髓功能抑制等,患者发生骨髓抑制后可能出现疲劳、出血、发热等症状,导致治疗延迟、减少药物剂量等,均会影响治疗效果,增加治疗成本［3-5］。血清TLR4 是重要的先天免疫的受体之一,TLR4 及其相关信号参与了造血稳态和造血疾病发病［6,7］。因此考虑TLR4 参与了化疗后骨髓抑制的相关机制。故本文将邵阳市中心医院2022 年1～8 月收治的93 例非小细胞肺癌患者作为研究对象,探讨血清TLR4 与化疗后骨髓抑制的相关性,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2022 年1～8 月邵阳市中心医院收治的93 例非小细胞肺癌患者,年龄40～80 岁；病理类型：鳞状细胞癌55 例,腺癌38 例；临床分期均采用TNM 分期第8 版。本研究经医院伦理委员会审批通过,所有患者均知情同意并签署知情同意书。

1.2 纳入标准 ①病理学检查确诊为非小细胞肺癌；②病历资料完整；③化疗方案为铂类为基础的双药化疗；④充分的骨髓造血功能；⑤体力评分>70 分；⑥血常规、心肌酶学、肝肾功能、凝血功能等未见明显异常。

1.3 排除标准 ①合并其他恶性肿瘤患者；②有凝血功能障碍、血液系统疾病、风湿免疫系统疾病、内分泌系统疾病等患者；③合并其他感染性疾病患者；④合并精神疾病或痴呆患者；⑤合并骨转移患者；⑥有化疗禁忌证,合并其他器官功能损伤不能接受化疗的患者。

1.4 方法

1.4.1 临床资料收集 利用病历系统收集患者年龄、性别、病理类型、体质量指数等资料。

1.4.2 血常规 采集患者清晨6 点的外周血,选择全自动血液分析仪检测血常规。

1.4.3 TLR4 血清水平 采集患者清晨6 点外周静脉血,离心得血清。运用人酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(江西艾博因生物科技有限公司)检测血清TLR4水平。标准品的加样: 设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50 μl。加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μl,然后再加待测样品10 μl。加样将样品加于酶标板孔底部。加酶:每孔加入酶标试剂100 μl,空白孔除外。温育:用封板膜封板后置37℃温育60 min。配液:将20 倍浓缩洗涤液用蒸馏水20 倍 稀释后备用。洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30 s 后弃去,如此重复5 次,拍干。显色:每孔先加入显色剂A 50 μl,再加入显色剂B 50 μl,37℃避光显色15 min。终止:每孔加终止液 50 μl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。测定:以空白孔调零,460 nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。

1.5 观察指标及判定标准

1.5.1 骨髓抑制发生情况 骨髓抑制分为0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级,判定标准见表1。其中0 级代表无,Ⅰ+Ⅱ级代表轻度,Ⅲ+Ⅳ级代表重度。

表1 骨髓抑制判定标准

1.5.2 化疗前后血清TLR4 水平 酶联免疫吸附测定法实验结果判读：用标准品浓度与OD 值计算出标准品的直线回归方程式Y=-3.503+96.340X,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。

1.6 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差 ()表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验,等级资料采用秩和检验；相关性采用Spearman 相关分析。化疗前后TLR4 水平比较运用直线相关分析。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓抑制发生情况分析 93 例中晚期非小细胞肺癌患者中共发生骨髓抑制78 例(83.9%),其中0 级 15 例(16.1%),Ⅰ级21 例(22.6%),Ⅱ级40 例(43.0%),Ⅲ级11 例(11.8%),Ⅳ级6 例(6.5%)。

2.2 临床特征分析 患者年龄<65 岁、体质量指数<18.5 kg/m2的骨髓抑制程度与年龄≥65 岁、体质量指数≥18.5 kg/m2比较,差异有统计学意义(P<0.05)；不同性别、KPS 评分、病理分型的骨髓抑制程度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 临床特征分析(n)

2.3 化疗前后血清TLR4 水平与骨髓抑制程度的相关性分析 化疗前,患者血清TLR4+的骨髓抑制程度与血清TLR4-比较,差异无统计学意义(P>0.05)；化疗后,血清TLR4+的骨髓抑制程度与血清TLR4-比较,差异有统计学意义(P<0.05)；化疗后血清TLR4 水平与骨髓抑制程度呈正相关(r=0.540,P<0.05)。见表3,表4,图1。

图1 化疗前后血清TLR4 水平与骨髓抑制程度的相关性分析

表3 化疗前血清TLR4+与血清TLR4-骨髓抑制程度比较(n)

表4 化疗后血清TLR4+与血清TLR4-骨髓抑制程度比较(n)

3 讨论

国家癌症中心数据显示,我国肺癌发病率及死亡率逐年上升。化疗联合其他治疗的综合方案依旧是目前非小细胞肺癌的主要治疗手段［8］。骨髓抑制是化疗主要的剂量限制性副反应,不仅会引发患者贫血、发热等,更会影响患者治疗效果［9］。

免疫系统是由复杂的分子和细胞机制组成,先天免疫是身体机能抵御内外部威胁的第一道防线。基于对微生物病原相关分子模式(PAMPs)、损伤相关的分子模式(DAMPs)和适应性免疫的认识,并通过产生大量因子介导由B 细胞主导的免疫活动［10］。先天免疫的主要分子传感器是模式识别受体(PRR),这是一种大蛋白类别,其中最重要的是血清Toll 样受体［11］。血清TLR4 是先天免疫的受体之一,在脂多糖(LPS)刺激下诱导下游因子聚集激活,最后能够促进促炎因子的表达,包括白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶(NOS2)等［12］。据报道,在暴露于LPS 或细菌后,血清TLR4 可发出依赖于非造血细胞的信号传导,如内皮细胞,其分泌粒细胞集落巨噬细胞刺激因子 (G-CSF),可通过诱导祖细胞进入骨髓谱系刺激粒细胞前体增殖的细胞因子,从而促进粒细胞的生成［13-15］。血清TLR4 可以在缺血、组织损伤和在病原体不存在或存在的创伤下激活。血清TLR4 主要的DAMPs 包括纤连蛋白、纤维蛋白原、热休克蛋白70、氧化的低密度脂蛋白、透明质酸片段等［16］。TLR4 上调受照射的骨髓细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶2(Nox2)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(Nox4)的表达并促进粒细胞生成。此外,血清TLR4 可防止骨髓微环境中脂肪组织的形成以及辐射引起的造血微环境的破 坏［17,18］。据研究,在体内LPS 与血清TLR4 的相互作用可直接诱导造血干细胞(HSC)增殖；然而长时间LPS 暴露会削弱HSC 的自我更新和再增殖活动［19］。骨髓异常增生综合征患者的造血干细胞/祖细胞(HSPC)不仅会增加血清TLR4 的表达,还会对TLR4 的配体更加敏感。分泌的内源性DAMPs 与血清TLR4 和髓样细胞受体髓系细胞分化抗原(CD33)结合,并通过HSPC上的直接和间接作用促进骨髓增生异常综合征(MDS)中的无效造血［20］。此外,刺激血清TLR4 信号传导可能对急性髓系白血病具有治疗效果。血清TLR4 激动剂可促进髓母细胞的死亡和分化,直接促进急性髓细胞性白血病(AML)的细胞死亡和分化［21］。

在临床上HSPC 获取困难,难以扩大应用。目前临床上对于化疗后骨髓抑制的诊断及检验依旧采用外周血样本。然而,虽然外周血细胞源于骨髓HSPC,但外周血细胞中各表达指标是否参与化疗所致骨髓抑制的发生机制正是本研究旨在探讨解决的问题。本实验以外周血清为标本,运用酶联免疫吸附测定法测定外周血中TLR4 的表达水平,结果显示,化疗后血清TLR4 水平与骨髓抑制程度呈正相关(r=0.540,P<0.05)。化疗前后血清TLR4 水平的变化考虑为化疗引起的组织损伤,释放内源性损伤因子,激活TLR4 的表达,促进先天免疫系统的促炎反应,通过下游反应链引发炎症反应。骨髓抑制程度与血清TLR4 水平相关,可能为骨髓组织中的骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)等细胞上的血清TLR4 激活,可促进HSPC 分化,分化相关血液细胞后释放入血,减轻患者骨髓抑制程度。

综上所述,血清TLR4 水平与非小细胞肺癌化疗后骨髓抑制存在相关性,TLR4 可能参与了化疗后骨髓抑制的发生机制。但本研究样本量较小,化疗周期为 1 次,运用的是外周血标本,实验结果的说明性有限,尚需进一步扩大样本量进行前瞻性研究,明确TLR4 与化疗骨髓毒性的具体机制,从而指导骨髓抑制的早期防治和优化治疗方案选择。