四川某奶牛场犊牛腹泻主要病原微生物的PCR检测

卜 娴，汤 承，岳 华

(西南民族大学，四川成都 610041)

犊牛腹泻是常见病，一年四季均可发生，常发于初春及夏末初秋气候多变季节[1]，腹泻犊牛临床上表现为严重腹泻，并伴随呕吐、机体脱水和生长发育不良等症状，严重时还会引起死亡，未断奶犊牛超过50%的死亡与腹泻相关[2]，是造成全球养牛业经济损失的最重要原因。犊牛腹泻是一种多因素疾病，可分为感染性因素和非感染性因素，造成犊牛腹泻的主要原因为感染性因素。有研究表明，与犊牛腹泻相关的常见病毒有牛A群轮状病毒(Bovine Rotavirus A，BRVA)、牛冠状病毒(Bovine coronavius，BCoV)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、牛诺如病毒(Bovine norovirus，BNoV)、纽布病毒(Nebovirus，NeV)和牛环曲病毒(Bovine torovirus，BToV)[3]，常见细菌有产肠毒素大肠埃希氏菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)和沙门氏菌(Salmonella)。

四川省某奶牛场有5 000多头成年牛，犊牛常年发生腹泻，是影响犊牛成活率的主要因素，为了解该奶牛场犊牛腹泻的原因，本文采用PCR方法对该场犊牛腹泻进行病原学检测，结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 发病情况 2021年春季该场300多头犊牛在2月龄内发生腹泻，表现为精神沉郁，喜卧，嗜睡，采食量下降，鼻镜干燥，体温升高，排出灰白色或淡黄色粥样粪便，肌肉注射抗菌药物无效，病死率约30%。无菌棉拭子采集腹泻粪便样本22份作为待检病料。

1.1.2 主要试剂 TrizolTMReagent、Prime ScriptTMRT、2×TaqPCR Master Mix、DNA标准DL 2 000，TaKaRa公司产品。

1.1.3 主要仪器 LifeECO基因扩增仪，杭州博日科技有限公司产品；凝胶成像系统、核酸蛋白电泳仪，Bio-Rad公司产品；高速离心机5804，Eppendor公司产品。

1.1.4 病原核酸 BRVA、BCoV、BVDV、NeV、BNoV、BToV、ETEC及Salmonella病原核酸，均由西南民族大学动物医学实验室提供。

1.2 方法

1.2.1 核酸提取 待检病料分别与PBS缓冲液按1∶5的比例充分重悬混匀，分成2份，1份5 000 r/min 4 ℃离心10 min，上清按照Trizol试剂盒 (RNAiso Plus) 说明书提取总RNA，用Prime ScriptTMRT试剂盒反转录成cDNA；另1份用酚-氯仿法提取DNA。

1.2.2 PCR检测 参照文献报道的PCR方法[4-11]分别检测待检样本中的BRVA、BCoV、BVDV、NeV、BNoV、BToV、ETEC及Salmonella，取PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像系统进行检测，并用SPSS21.0软件对检测结果进行统计学分析。引物由生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成，引物信息见表1。

表1 PCR检测引物信息

1.2.3 BRVA基因型分型 采用RT-PCR方法，按照Gomara M I等[12]与Abe M等[13]报道的引物(表2)扩增BRVA阳性样本中的VP7、VP4基因片段，PCR产物经15 g/L琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统成像，PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，用轮状病毒分型软件(https://www.viprbrc.org/brc/rvaGenotyper.)根据测序结果确定BRVA的G型和P型。

表2 VP7、VP4基因片段扩增引物信息

2 结果

2.1 腹泻相关病原PCR检测

从22份犊牛腹泻粪便样本检出BRVA、BCoV、NeV和BToV 4种病毒的特异性条带，检出率分别为81.82%、31.82%、27.27%和13.64%(图1)，其余4种病原均未检出。

2.2 混合感染情况

对检测结果分析可见，该场犊牛腹泻主要由BRVA、BCoV、NeV和BToV 4种病毒感染所致，总阳性率为86.36%。在19份阳性样本中有12份存在2种及以上病毒混合感染的情况，总混合感染率为63.16%，混合感染病毒组合有BRVA+BCoV、BRVA+NeV、BRVA+BToV、BRVA+BCoV+NeV，混感率分别为33.33%、25%、16.67%、25%(表3)。

2.3 BRVA基因型

从检测结果可见，BRVA的感染率最高，基因分型结果显示，从18份阳性样本中扩增出15个VP7基因片段，均为G10型，扩增出7个VP4基因片段，其中4个为P[1]型、3个为P[11]型，从7个阳性样本中同时扩增出VP7和VP4基因片段，为4个G10P[1]型和3个G10P[11]型。由此得知，该奶牛场至少存在1种G型(G10型)和2种P型(P[1]、P[11])BRVA。

M.DNA标准DL 2 000；1～22.被检样本；P.阳性对照；N.阴性对照；A.牛A群轮状病毒；B.牛冠状病毒；C.纽布病毒；D.牛环曲病毒M.DNA Marker DL 2 000；1-22.Samples；P.Positive control；N.Negative control；A.BRVA；B.BCoV；C.NeV；D.BToV

表3 病毒混合感染

3 讨论

犊牛腹泻严重影响犊牛早期的生长发育和后期生产性能的发挥。本研究从犊牛腹泻粪便中检出BRVA、BCoV、NeV和BToV 4种病毒，证实BRVA等4种病毒是造成该奶牛场犊牛腹泻的主要原因。产肠毒素大肠埃希氏菌及沙门氏菌均未检出，这可能与奶牛场大量使用抗菌药物有关。大量报道显示，上述4种病毒感染是造成我国奶牛场犊牛腹泻的常见原因。李然等[14]的研究表明辽宁省某奶牛场的犊牛BRVA感染率为83.3%；阿比克哈莫[15]对国内部分省区奶牛进行了BCoV的病原流行病学调查，平均阳性率为18.95%；NeV和BToV作为国内犊牛腹泻的新发病原，广泛流行于我国多个省份的奶牛中，检出率分别为48.1%[16]和5.56%～21.73%[9,17]，表明NeV和BToV与犊牛腹泻密切相关；张亮等[18]表明BVDV是致山东省奶犊牛腹泻的主要病毒。尽管在本研究中细菌未检出，但是有报道表明其在某些养殖场中仍较为常见，例如，张迪等[19]发现黑龙江某奶牛场存在较为严重的大肠埃希氏菌及隐孢子虫感染，感染率分别为75%和25%。由此可见，导致犊牛腹泻的病原种类较多，其中病毒是主要病原，且不同地区、不同牛场致病原有较大差异，这提示我们应该根据每个场的具体发病情况来制定相应的疾病防治方案。

犊牛感染了BRVA之后，当存在与其他病毒的混合感染或继发细菌感染时，动物发病更急，病程更短，病死率更高[20]。在该奶牛场中，存在BRVA+BCoV、BRVA+NeV、BRVA+BToV和BRVA+BCoV+NeV 4种不同组合的混合感染，感染率分别为33.33%、25%、16.67%和25%，混合感染组合并不具有规律性。从文献报道可见，奶牛场存在多种不同的混合感染组合，例如BRVA+BCoV、BRVA+BCoV+BVDV、BRVA+BCoV+Salmonella[14,21-23]。奶犊牛腹泻中BRVA+BCoV混合感染组合较为常见，多种病原混合感染可能会增加临床表现的严重程度，给犊牛腹泻的诊断带来困难。因此，在诊断的过程中需要同时对多种常见病原进行检测，以便为更加精准的防治提供科学依据。

由于在该场中BRVA检出率最高，因此对其进行了基因型分型，从中得出该奶牛场BRVA基因型有G10、P[1]和P[11]型，基因型组合有G10P[1]和G10P[11]。在我国BRVA中，主要流行的G型有G6和G10，P型有P[1]、P[5]和P[11][24]，不同年份流行株毒株的优势基因型组合是不一样的，约2年更换一次[25]，最常见的基因型组合是G6P[5]、G10P[5]、G6P[11]和G6P[1][26-27]。由此可知，BRVA的G、P基因型具有丰富的遗传多样性，而不同基因型毒株之间的交叉免疫保护性低，这给疫苗的研发带来了极大的困难。因此，对BRVA进行基因型分型，及时监测毒株的遗传多样性对轮状病毒病的防控尤为重要。

针对多种病原的混合感染，目前大部分病原都没有有效的疫苗进行防控，且从该奶牛场可见，饲养环境卫生较差是引起犊牛腹泻的主要原因。因此，在犊牛养殖过程中综合防控仍然是最主要的手段，特别是犊牛舍的环境卫生，要保持干燥、通风，同时需要做好保温防寒工作。此外，目前对于轮状病毒特异性抗体治疗的效果较好[28]，对于其他病原也可以研发类似的治疗性抗体，这可能是一个有效的防治手段。