副猪嗜血杆菌14型的分离鉴定和药敏试验

徐引弟，王治方，焦文强，朱文豪，李海利，张青娴，郞利敏，王克领

(河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南郑州 450002)

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis，HPS)是猪副猪嗜血杆菌病的病原菌，主要引起猪的多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎。副猪嗜血杆菌病在世界范围内存在，是断奶、保育仔猪死亡的原因之一，是临床混合感染的主要病原之一，给养猪业造成较大的经济损失，影响养猪业的健康发展[1]。

副猪嗜血杆菌临床血清型较多，有15个血清型，临床上还有20%以上的不可分型菌株，各地流行菌株血清型不一，各血清型之间缺乏免疫交叉保护能力。疫苗免疫接种是防控副猪嗜血杆菌病的最佳途径，国内商品化疫苗多为针对血清4型、5型的二价疫苗或血清4型、5型、13型的三价或血清4型、5型、12型、13型的四价疫苗，目前国内主要流行血清4型、5型、12型、13型、14型，血清14型没有疫苗[2]。菌株毒力与其携带的毒力基因有密切关系，副猪嗜血杆菌血清1型、5型、10型、13型、14型为高毒力；血清2型、4型、15型为中等毒力；其他血清型划为无毒力型[3]。但也发现HPS临床菌株毒力与血清型并不完全相关，同一血清型不同菌株毒力不同，甚至存在明显差异。不同地区HPS临床菌株耐药表型不同，同一地区菌株耐药性也呈现动态变化，大都表现出耐药增强趋势，这些变化使副猪嗜血杆菌病临床防控更加复杂。近年来，在临床典型病例中不断分离出副猪嗜血杆菌1型、2型、7型、6型、9型、14型等血清型，使得副猪嗜血杆菌的感染流行情况更为复杂。需要根据临床感染情况开发有针对性的血清型疫苗，更好的更有效的防控副猪嗜血杆菌病。14型菌株的研究报道越来越多，提示副猪嗜血杆菌14型在临床感染率越来越高。[4-5]。本研究对1株副猪嗜血杆菌血清14型菌株进行了毒力基因检测、毒力试验和药敏试验等，旨在为副猪嗜血杆菌血清14型的流行病学研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料来源 采集来自河南某规模化猪场具有疑似副猪嗜血杆菌病临床症状的3头保育猪的肺脏、心血、脑、关节液等病料共12份，发病猪表现为发热、呼吸困难、关节肿胀、跛行、皮肤及黏膜发绀、站立困难甚至瘫痪、僵猪或死亡。

1.1.2 试验用动物 副猪嗜血杆菌ELISA试剂盒检测抗体为阴性的健康保育猪20头，体重20 kg左右，购自郑州郊区某猪场。

1.1.3 主要试剂 胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)，碧迪医疗器械(上海)有限公司产品；犊牛血清、50×TAE浓缩液琼脂糖和DNA提取试剂盒，生工生物工程(上海) 股份有限公司产品；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶Ⅰ，NAD)， Roche公司产品；TaqPCR master mix、DNA标准DL 2 000、DNA提取试剂盒等PCR试剂，宝生物工程(大连)有限公司产品；基因引物，北京擎科生物科技有限公司合成；药敏片，杭州滨河微生物试剂有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 Thermo 5020 PCR扩增仪、Thermo 1300SERIES A2生物安全柜，赛默飞世尔科技(中国)有限公司产品；电泳仪(DYY-6型)，北京六一生物科技有限公司产品；凝胶成像系统，沙船(天津)生物科技发展有限公司产品；5418台式高速离心机，Eppendorf公司产品。

1.2 方法

1.2.1 副猪嗜血杆菌的分离培养 培养基配制参照文献[5]，无菌条件下采集发病或死亡猪的肺脏、心血、淋巴结、脾脏、脑、关节液等病料接种于含有NAD的TSA固体培养基上，37 ℃恒温培养箱中培养36 h，挑取疑似菌落进行传代纯化，再培养24 h～48 h后观察副猪嗜血杆菌的菌落及菌体形态。

1.2.2 引物设计 参照文献[6-8]设计合成副猪嗜血杆菌16S rRNA基因特异性引物和副猪嗜血杆菌血清型14引物，引物序列和扩增片段长度见表1。

1.2.3 副猪嗜血杆菌的鉴定和血清型鉴定 将临床分离菌株分别接种于TSA平板(含50 mL/L的犊牛血清，0.1 mg/mL的NAD)上，放置于体积分数为5%的CO2培养箱，37 ℃培养36 h，挑取典型菌落，按照DNA提取试剂盒说明书分别提取菌株的DNA，分装备用。PCR反应体系为25 μL，体系包括10×TaqPCR master mix 13 μL，上、下游引物各1.0 μL，无菌水5.0 μL，模板5 μL。反应条件为：94 ℃变性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min，PCR产物于4 ℃保存。取PCR产物10 μL，经10 g/L琼脂糖凝胶100 V电压下电泳45 min后用凝胶成像系统分析观察结果，阳性结果测序比对。

表1 副猪嗜血杆菌鉴定和血清型鉴定引物

1.2.4 毒力基因检测 参照文献[9-10]合成副猪嗜血杆菌毒力基因的引物(表2)，以提取的菌株DNA为模板进行PCR扩增检测，鉴定菌株的毒力基因。

1.2.5 致病性试验 将20头保育猪随机分为2组，1组对照组和1组试验组，每组10头。将副猪嗜血杆菌分离株接种TSB液体培养基，37 ℃摇床培养24 h后，测定菌体浓度，连续10倍稀释涂布固体平板，活菌计数，计算原液菌体浓度，调整至109CFU/mL。试验组动物通过腹腔内接种3 mL副猪嗜血杆菌液体培养物，对照组动物通过腹腔内接种3 mL灭菌的TSB液体培养基。注射后连续观察2周，观察并记录其发病数和死亡数等情况。

表2 毒力基因引物序列

1.2.6 药敏试验 采用纸片扩散法，挑取分离株的菌落，TSB(含50 mL/L的犊牛血清，0.1 mg/mL的NAD)培养过夜，调整浓度为0.5麦氏单位的菌悬液，用灭菌棉签蘸取细菌悬液，均匀涂满TSA平板(含50 mL/L的犊牛血清，0.1 mg/mL的NAD)表面；用灭菌镊子夹取药敏纸片均匀的贴于TSA平板上，置于体积分数为5%的CO2、37 ℃培养36 h，测量抑菌圈大小，判断结果。

2 结果

2.1 细菌的分离培养

通过对采集的疑似样品进行细菌分离、纯化、鉴定，分离出1株疑似副猪嗜血杆菌，长出一致的针尖状大小、无色透明、光滑、湿润的，直径大小为1 mm～2 mm的菌落；纯化的同时并接种于不含NAD的TSA固体培养基上，在不含NAD的TSA培养基上不能生长；挑取纯化的单个菌落进行革兰氏染色镜检，观察菌体形态特征为革兰氏阴性菌，细长杆菌，多丝状的菌体如图1。

2.2 分离菌株鉴定和分型鉴定

通过PCR扩增，临床菌株均扩增出822 bp、730 bp 2个条带，大小与副猪嗜血杆菌血清14型目的条带一致，表明临床分离菌株为副猪嗜血杆菌，血清型为14型(图2) 。通过基因比对，分离株与血清14型副猪嗜血杆菌标准株的16S rRNA、funAB基因序列的同源性均在100%。经PCR分子血清分型鉴定，结果为血清型14型，鉴定结果见图2。将分离鉴定的血清14型副猪嗜血杆菌命名为HN1513。

图1 副猪嗜血杆菌分离株的菌体形态

2.3 毒力基因测定结果

通过PCR扩增测定，共检测出capd、vta1、vta2、vta3、wza、hhdA、hhdB、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC、espP13种毒力基因(图3)。

2.4 动物感染试验结果

观察发现，HN1513株接种组在接种副猪嗜血杆菌24 h后表现出喘气、呼吸困难等症状，体温升高，耳部、腹部及臀部发绀，并出现转圈，2 d后开始出现死亡，共死亡8头。对照组动物在试验期间体温正常,且无明显的呼吸道症状。

结束后处死试验组动物，同时处死10头对照组动物，采集病料，进行细菌分离。HN1513株接种组剖检肺部有大量纤素样渗出，与胸膜粘连，心包积液，绒毛心，脑部出血；对照组剖检均未发生明显的病理变化，对照组的10份病料均未分离到副猪嗜血杆菌，试验组的10份病料中均分离到副猪嗜血杆菌，PCR鉴定结果与接种菌株一致。

综合试验结果，副猪嗜血杆菌株HN1513株表现为毒力较强的菌株。

M.DNA标准DL 2 000；1～2.HN1513株的16S rRNA基因扩增；3.血清14型标准株的16S rRNA基因扩增；4～6.HN1513株血清14型的funAB基因扩增；7.血清14型标准株的的funAB基因的扩增；8.阴性对照

2.5 药敏试验结果

选用18种常用抗菌药物对标准株和临床菌株进行耐药表型检测(表3)。结果表明，分离株对头孢他啶、氟苯尼考、头孢噻呋、氨苄西林、强力霉素、土霉素、氧氟沙星敏感，对阿莫西林、新霉素、卡那霉素、替米考星、四环素、环丙沙星、红霉素中介，对青霉素、阿米卡星、诺氟沙星、复方新诺明耐药。

M.DNA标准DL 2 000；1.capd基因；2.vta1基因；3.vta2基因；4.vta3基因；5.wza基因；6.hhdA基因；7.hhdB基因；8.ompP2基因；9.nanH基因；10.cdtA基因；11.cdtB基因；12.cdtC基因；13.espP2基因

表3 药敏试验抑菌圈直径及判定结果

3 讨论

副猪嗜血杆菌是养猪行业的重要细菌性病原之一，可以单一病原感染发病，更多是作为继发病原感染猪群，引起混合感染之后，给养猪业造成巨大经济损失。副猪嗜血杆菌临床血清型较多，不同血清型菌株的毒力及致病性不同，临床感染发病情况也不尽相同。本室研究表明河南地区主要流行菌株为血清4型、血清5型和血清7型，血清4型血清和5型相关报道也较多，而血清14型报道较少[11-12]。本试验对河南地区1株副猪嗜血杆菌血清14型临床菌株进行了生物学特性研究，该分离株携带有13种主要毒力基因，毒力较强，药敏试验结果表明，分离株对头孢他啶、氟苯尼考、头孢噻呋、氨苄西林、强力霉素、土霉素、氧氟沙星敏感。

菌株毒力的强弱与其携带的毒力因子有着直接关系，副猪嗜血杆菌毒力因子多而复杂，致病机理尚未完全研究清楚，本试验筛选检测的13个毒力基因可能是副猪嗜血杆菌的致病关键因子，通过毒力因子检测，该分离株检测出全部13种毒力基因，保育猪致病性试验表明该分离株毒力较强，属于强毒株，与毒力基因检测的结果有一定的关联性[9]。

抗菌药物仍是当前防控副猪嗜血杆菌病的有效途径，但由于养殖过程中抗菌药物长期盲目滥用或不规范使用，导致细菌耐药性越来越严重，使得药物抗菌效果越来越差，给养殖户造成了很大的经济损失[13]。通过耐药表型检测，该分离菌株对头孢他啶、氟苯尼考、头孢噻呋、氨苄西林、强力霉素、土霉素、氧氟沙星较为敏感，对其他11种药物敏感性较低或耐药，分离株表现出多重耐药现象。因此，筛选敏感药物，科学合理使用抗菌药物是防控副猪嗜血杆菌病的关键。

本试验通过对河南某规模化猪场副猪嗜血杆菌血清14型生物学特性研究，从基因检测结果、致病性试验和耐药表型结果来看，临床HPS血清14型菌株表现出较强的毒力，有明显的耐药性，在生产实践中应当重视副猪嗜血杆菌血清14型的危害和防控。