粉防己碱与多西环素联用对耐药沙门氏菌的抗菌增敏作用及机制研究

易开放，张俊锴，刘佩仪，韩荣嘉，苗青青，潘玉善，赵金凤，翟亚军，胡功政

(河南农业大学动物医学院，河南郑州 450046)

沙门氏菌(Salmonella)是对人及动物均具有严重致病性的革兰氏阴性胞内菌[1]，能使人、哺乳动物及禽类发病，出现胃肠炎、腹泻及败血症等症状[2]。多西环素等抗菌药物是治疗沙门氏菌感染的常用药物，但由于抗菌药物的不合理使用，使沙门氏菌的耐药性不断扩散，同时兽药残留的问题也日益突出[3-4]。研究表明，外排泵是引起细菌耐药性产生的重要因素，沙门氏菌是主动外排泵系统种类最多的细菌之一，其中AcrAB-TolC是产生耐药最重要的外排泵，外排多种抗菌药物可以使细菌产生高水平、多重耐药[5-6]。研究发现，中药具有多成分、多靶点的作用特点，其有效成分在机体内通过多种途径的综合实现了对细菌的抑菌作用，其抑菌机制包括破坏细胞壁和细胞膜的完整性，抑制细菌酶的活性，抑制外排泵，抑制核酸和蛋白的合成与功能等[7]。由于中药有特殊的逆转耐药性作用，与抗菌药物联合可表现出优异的疗效，故中药与抗菌药物联用防治细菌性疾病成为目前研究的热点[8-9]。粉防己碱(tetrandrine，TET)属双苄基异喹啉类生物碱，是传统中药粉防己有效成分，已证明具有抗微生物、抗真菌感染、抗肿瘤、逆转多药耐药等多种生物活性[10-11]。目前尚无关于粉防己碱与抗菌药物联用对沙门氏菌抑菌作用的报道，本研究旨在观察粉防己碱与多西环素对沙门氏菌的体外联合抗菌效果，并从外排泵方面探讨其联合用药的作用机制，以期为临床联合用药控制耐药性沙门氏菌感染提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 鼠伤寒沙门氏菌标准株®CVCC 541(命名为JS) ，购自中国兽药药品监察所；12株沙门氏菌分离株，均为由本实验室保存的经过鉴定的临床分离菌株。

1.1.2 药品与试剂 粉防己碱，成都瑞芬思生物科技有限公司产品；溴化乙锭(ethidium bromide，EtBr)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；多西环素，广州翔博生物科技有限公司产品；普通LB琼脂、LB肉汤、MHB肉汤、SS琼脂，青岛海博生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 Spapk 10M酶标仪，瑞士帝肯(Tecan)公司产品；紫外分光光度计，上海奥析科学仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌复苏 取菌种50 μL接种于5 mL新鲜LB肉汤，37 ℃、180 r/min振荡培养过夜。用一次性接种环蘸取适量菌液接种于SS琼脂培养基上，37 ℃静置培养16 h～18 h，置于-20 ℃ 冰箱备用。

1.2.2 粉防己碱和多西环素的配制 将粉防己碱用1 mol/L的盐酸溶解后配制成5 120 μg/mL的溶液，调pH至4；准确称取适量的多西环素，配制成浓度为5 120 μg/mL的母液50 mL。均用0.22 μm的滤膜过滤除菌，置-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.3 单药最小抑菌浓度测定方法 参照CLSI规定的操作方法[12]，采用微量肉汤稀释法分别测定多西环素、粉防己碱对沙门氏菌的MIC，试验重复3次，结果取平均值。

1.2.4 联合药敏试验 采用96孔棋盘法[13]，测定粉防己碱联合多西环素在体外对沙门氏菌的协同效应。药物相互作用效应通过计算其部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration indices，FICI)来判断。

判断标准：FIC≤0.5，协同作用；0.52，拮抗作用。

1.2.5 体外时间-杀菌曲线 根据棋盘试验的结果，选择呈协同作用的标准菌JS和临床分离沙门氏菌S290，通过活菌菌落计数的方法制作时间-杀菌曲线，进一步验证粉防己碱与多西环素联合的动态杀菌作用。设置空白组，1/2×MIC DOX、1/2×MIC TET、1/4×MIC TET单药组，1/2×MIC DOX+1/2×MIC TET、1/2×MIC DOX+1/4×MIC TET联合组。将混匀后不同组合的离心管放置于37 ℃振荡培养箱，分别在0、2、4、8、12、24 h时间点取样，10倍系列稀释后滴在LB琼脂板上， 37 ℃培养箱培养20 h，进行菌落计数，以时间为横坐标，log10(CFU/mL) 为纵坐标绘制曲线[14]。

判断标准：协同作用，联合组菌液浓度与杀菌效果最优的单药组比较，菌落数降低≥2 log10(CFU/mL)；相加作用，联合组菌液浓度与杀菌效果最优的单药组比较，菌落数降低1 log10(CFU/mL)～2 log10(CFU/mL)。

1.2.6 溴化乙锭蓄积试验 配制1 mmol/L的荧光探针EtBr和1×PBS(含5 mmol/L葡萄糖)的缓冲液。将沙门氏菌于37 ℃、180 r/min振荡培养至指数期；以11 000 r/min转速离心3 min；用缓冲液1×PBS反复洗涤2次后，再次悬浮在缓冲液中，配制OD6 00 nm=0.3的菌悬液。在该菌悬液加入EtBr使其终浓度为5 μmol/L。设置7个试验组：1/2MIC DOX、1/2MIC TET、1/4MIC TET、1/2MIC DOX+1/2MIC TET、1/2MIC TET+1/4MIC TET、CCCP(羰基氰氯苯腙)、1/2MIC DOX+ CCCP，其中CCCP为阳性对照组。另设不加任何药物的阴性对照组，混匀后37 ℃孵育1h，用Spark多功能酶标仪以激发波长530 nm，发射波长600 nm 进行荧光强度测定[15-16]。试验重复3次，结果取平均值。

1.2.7 数据分析 试验数据用SPSS 26、GraphPad Prism 8等软件进行统计处理，差异显著性检验用方差分析。

2 结果

2.1 单用体外药敏试验结果

如表1所示，多西环素对沙门氏菌的MIC值为4 μg/mL～64 μg/mL，在临床沙门氏菌中有2株敏感，占16.67%，有10株耐药，占83.33%。粉防己碱对沙门氏菌的MIC值为320 μg/mL～640 μg/mL，抑菌作用较弱。

2.2 联合药敏试验结果

如表2所示，13株菌中有11株呈协同作用，占84.62%；2株呈相加作用占15.38%，无拮抗和无关作用。粉防己碱和多西环素联用对沙门氏菌FICI的平均值为0.47，具有良好的协同作用。

2.3 时间-杀菌曲线结果

1/2×MIC的多西环素在体外对沙门氏菌作用中，对JS在12 h以前有一定的抑菌效果，杀菌曲线呈水平状态(图1)；对S290无杀菌或抑菌效果(图2)。1/2×MIC、1/4×MIC粉防己碱单药的杀菌曲线都呈持续增长的趋势，也无杀菌或抑菌作用。

1/2×MIC、1/4×MIC粉防己碱与1/2×MIC多西环素联用，在12 h时对JS的杀菌曲线呈现下降的趋势(图1)，与1/2×MIC多西环素单药组相比，菌液浓度分别下降了4.04、1.88 log10(CFU/mL)，可见1/2×MIC粉防己碱与1/2×MIC多西环素联合在12 h时协同效果显著。在24 h时，1/2×MIC、1/4×MIC粉防己碱与1/2×MIC多西环素联用与单药组相比，菌液浓度分别降低了3.42、2.87 log10(CFU/mL)，说明这两种联合使用具有协同抑菌效应。

1/2×MIC、1/4×MIC粉防己碱与1/2×MIC多西环素联用，在8 h时对S290的杀菌曲线呈现下降的趋势(图2)，与1/2×MIC多西环素单药作用相比，菌液浓度分别下降了4.65、2.56 log10(CFU/mL)，说明有协同效应。在24 h时，1/2×MIC、1/4×MIC粉防己碱与1/2×MIC多西环素联用与单药相比，菌液浓度分别降低了2.27、0.23 log10(CFU/mL)。可见1/2×MIC粉防己碱与1/2×MIC多西环素联合协同效果在8 h时更显著，在24 h内均有明显的协同抑菌作用。

表1 粉防己碱和多西环素单用及联合应用药敏试验

表2 两药联用对沙门氏菌FIC构成比

2.4 粉防己碱和多西环素单用及联合对S290外排泵活性的影响

如图3所示，阳性对照CCCP组EtBr的荧光强度显著升高，作为已知的外排泵抑制剂CCCP能抑制细菌外排泵的作用，使EtBr在胞内的蓄积量增加。与阴性对照组相比，当加入不同药物及浓度时，除多西环素单药组，其他试验组荧光强度均极显著(P<0.01)升高。

与1/2×MIC DOX组比较，单药1/4×MIC TET、1/2×MIC TET，两药1/2×MIC DOX+1/4×MIC TET、1/2×MIC DOX+1/2×MIC TET组荧光强度均极显著升高(P<0.01)；与1/2×MIC DOX+1/4×MIC TET组相比较，单药1/4×MIC TET组荧光强度极显著降低(P<0.01)，两药1/2×MIC DOX+1/2×MIC TET组荧光强度极显著(P<0.01)升高。粉防己碱与多西环素联用时，荧光强度均极显著大于多西环素单药组(P<0.01)，EtBr在胞内的蓄积量增加，表明粉防己碱对外排泵有明显的抑制作用，且表现出剂量依赖性。

图1 粉防己碱和多西环素单用及联合对JS的时间-杀菌曲线

图2 粉防己碱和多西环素单用及联合对S290的时间-杀菌曲线

**表示与空白对照组相比，P<0.01；##表示与1/2×MIC DOX相比，P<0.01；&&表示与1/2×MIC DOX+1/4×MIC TET组相比，P<0.01

3 讨论

本试验表明，12株分离沙门氏菌体中的10株(83.33%)对多西环素耐药，呈现很高的耐药率，单药的临床治疗价值已大为降低。粉防己碱自身对沙门氏菌的抑菌作用较弱，但当其(亚MIC粉防己碱，40 μg/mL～160 μg/mL)与多西环素联合时，可显著增强多西环素对沙门氏菌的抗菌活性，并使50.0%的沙门氏菌(5/10)由耐药逆转为敏感。时间-杀菌曲线试验结果也表明，两药联合对沙门氏菌具有良好的协同作用或相加作用。沙门氏菌对包括多西环素在内的四环素类耐药机制有多种，主动外排是其重要的耐药机制之一[17]。目前研究报道已证实，粉防己碱是有抑制外排泵作用的天然药物，外排泵抑制剂不仅可以解决由外排泵介导的耐药问题，增加细菌对药物的敏感性，而且还可以减少或消除细菌的耐药[18]。

本试验应用荧光染料EtBr作为主动外排泵的作用底物，示踪外排泵活性。EtBr本身只产生微弱的荧光，当其自由扩散进入细菌胞内，与胞内的DNA结合而产生强荧光，但细菌外膜上的外排泵可主动将其泵出胞外，EtBr在胞内的蓄积减少，荧光值趋势降低。外排泵抑制剂CCCP通过抑制外排泵的能量来源抑制外排泵的作用，使EtBr在胞内的蓄积量增加，荧光值增长迅速[19]。本试验发现粉防己碱能增强多西环素对沙门氏菌的抗菌作用，EtBr蓄积试验表明，粉防己碱能使细菌细胞内EtBr蓄积量增加，荧光强度极显著升高，显著抑制外排泵活性，说明两药联合时，粉防己碱可阻止多西环素的外排，促进多西环素在细菌细胞中的积累，从而提高多西环素的抗菌活性，粉防己碱与多西环素联合用药对治疗耐药沙门氏菌感染有重要应用价值。