基于Tris辅助法制备猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条

文海燕，严 昊，潘 艳，冯建远，江明生*，陈海兰*

(1.广西大学动物科技学院，广西南宁 530005；2.广西农业职业技术大学，广西南宁 530007；3.广西农垦永新畜牧集团金光有限公司，广西南宁 530042)

猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PoRV)是含11个双链RNA的双股RNA病毒，基因组分11个基因节段，分别编码6种结构蛋白(VP1、VP2、VP3、VP4、VP6和VP7)和5或6种非结构蛋白(NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5和NSP6)，PoRV的11个基因之间均易发生重配事件。该病毒通过粪-口途径传播，仔猪易感，可引起仔猪精神烦躁、呕吐、厌食以及严重腹泻等，在引起仔猪生长缓慢的同时，导致高病死率[1]。育成猪和成年猪通常为隐性感染，引起急性胃肠炎，表现为食欲下降、冷漠和不同程度的腹泻[2]。在腹泻仔猪中经常发现病毒、细菌和寄生虫混合猪轮状病毒感染。PoRV感染仔猪呈世界性流行，各国猪场中阳性率为3.3%～67.3%，对世界养猪业造成了严重的经济损失[2]。国内的病原学检测结果显示，PoRV在我国规模化猪场中普遍存在，仔猪腹泻粪便中阳性率为7.69%～28.76%[3-4]。目前，尚无针对该病毒的有效治疗药物，虽然开发出了相应的疫苗，国内临床应用最广泛的疫苗是中国农业科学院哈尔滨兽医研究所研制的胃-腹-轮腹泻三联弱毒苗，但由于PoRV区域流行不同和遗传多样性，导致该病毒不能完全被控制，因此，当前疫苗的保护作用较有限[5]。轮状病毒基因群、基因型多样及该病毒与猪其他引起肠道症状病毒发病症状相似，在临床上难以辨别，故对本病毒快速准确检测方法的建立显得尤为重要。

目前，猪轮状病毒的临床检测多是借助实验室对病原检测分析，包括酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)、实时荧光定量RT-PCR(RT-qPCR)和逆转录-环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)、原位杂交技术、纳米孔测序等[6]。ELISA灵敏度较高，但需时间长，操作较繁琐[7-9]。后几种检测技术具备很高的灵敏度和特异性，但费用较高，且对操作人员技术和检测环境要求较高[11]。上述技术对仪器设备的高要求，限制了其在现场或临床诊断中的使用[9]。免疫层析技术始于20世纪后期，是一种将色谱层析和免疫技术相结合的快速检测技术[10]。其中，最经典的一种标记检测技术是胶体金免疫层析技术[11]。传统的胶体金免疫层析技术，依靠大量金颗粒(AuNPs)聚集达到肉眼可见效果，但由于其检测周期短、成本低、对仪器设备和人员没有特殊要求，在即时快速检测方面发挥着不可替代的作用，发展前景广阔。胶体金免疫层析技术是否可以成功建立，胶体金的质量是决定性因素之一，因为胶体金的质量好坏会影响后期标记的效果、显色、灵敏度、特异性等。近几年，路飞雪等学者证明在预热的柠檬酸钠溶液中加入三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(tris hydrochloride)，可以在水介质中获得高纯度、单分散的球形金纳米粒子(AuNPs)，且其粒径均匀，稳定性好[12]。本试验通过改良标记胶体金的制备方法，采用Tris辅助法制备优质胶体金，标记轮状病毒检测抗体作为标签，研制一种用于粪便样品中猪轮状病毒检测的胶体金免疫层析试纸条，并考察该试纸条的性能。该试纸条具备良好的灵敏性、特异性和稳定性，可在10 min内完成检测。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 临床样品和猪轮状病毒阳性粪便，由南宁诸福莱动物健康管理有限公司收集和保存。特异性样品、阴性样品和阳性样品，由广西大学动物科技学院收集和保存。

1.1.2 抗体 A群轮状病毒单克隆抗体Ab1(3.18 mg/mL)、Ab2(4.9 mg/mL)，美国Meridian公司产品。

1.1.3 主要试剂 羊抗鼠IgG(10 mg/mL)，生工生物工程(上海)股份有限公司产品；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、柠檬酸钠、四氯金酸，美国Sigma公司产品；碳酸钾(K2CO3)、二甲基硅油、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris hydrochloride)，索莱宝科技(北京)有限公司产品；硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，NC)，德国Sartorius公司产品；样品垫、结合垫、吸水纸、聚氯乙烯底板(PolyVinyl Chloride，PVC)，上海金标生物科技有限公司产品。

1.1.4 主要仪器 高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司产品；微电脑自动斩切机、数控裁条机、三维划膜喷金仪，上海金标生物科技有限公司产品；粒径与电位测定仪，马尔文帕纳科有限公司产品；日立透射电子显微镜，日本日立公司产品；紫外可见光分光光度计，日本岛津仪器有限公司产品；恒温磁力搅拌器，艾卡仪器设备有限公司产品；超纯水仪，中国越纯有限公司产品；数显干燥箱，上海博讯实业有限公司；通风橱，湖南朗圣实验室技术发展有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 胶体金的制备 采用柠檬酸钠还原法和Tris辅助法制备胶体金。

(1)柠檬酸钠还原法制备胶体金：在250 mL三角烧瓶中，加入99 mL的超纯水、1 mL 10 mg/mL的四氯金酸溶液和磁力搅拌子1个，在磁力搅拌器上加热至沸腾，加入1 mL 10 mg/mL柠檬酸钠溶液，继续搅拌15 min，继续煮沸10 min出现透明的橙红色，之后颜色不再变化，自然冷却至室温，用超纯水定容至原液面高度处，常温避光保存。

(2)Tris辅助法制备胶体金：取140 mL纯净水于三口烧瓶中，放入搅拌子，将三口烧瓶放置在油浴锅中油浴(二甲基硅油)加热，设定恒温磁力搅拌器温度为137 ℃，搅拌转速为900 r/min，油浴温度100 ℃，将10 mL 10 mg/mL柠檬酸钠溶液加入三口烧瓶中，继续加热40 min，温度稳定于137 ℃左右，注入1 mL 10 mg/mL四氯金酸溶液，60 s后，再将5 mL 0.1 mol/L Tris溶液注入三口烧瓶的漩涡中心处，30 min后，温度设置成100 ℃，开启通风橱加速降温，油浴温度降至100 ℃，快速将1 mL 10 mg/mL四氯金酸注至三口烧瓶中的漩涡中心处，反应30 min。重复上一步骤，反应结束后停止加热，在搅拌状态下自然冷却至室温，避光保存。观察上述两种方法所制胶体金的颜色等外观特征，利用紫外分光光度计扫描其紫外吸收图谱，通过粒径分析仪测定粒径大小及分布情况，采用透射电镜测定其均一性和颗粒大小。

1.2.2 胶体金最适标记pH的确定 取1 mL胶体金溶液和5 μg Ab2抗体，于6只1.5 mL透明玻璃瓶，分别加入不同体积的K2CO3(0.1 mol/L)调整pH，确定最适标记pH。

1.2.3 胶体金最适标记蛋白浓度的确定 取1 mL胶体金溶液和2 μL K2CO3(0.1 mol/L)，于6只1.5 mL透明玻璃瓶，分别加入不同体积的Ab2抗体，确定最适标记蛋白浓度。

1.2.4 灵敏度试验 制备不同浓度的阳性样品，稀释度分别为1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶1 000,并以样品稀释液阴性对照，猪轮状病毒阳性粪便为阳性对照。取60 μL不同浓度各组样品分别滴加到样品垫上，静置10 min，肉眼观察检测结果并拍照，确定试纸的检测灵敏性。

1.2.5 特异性试验 分别用试纸条检测猪传染性胃肠炎病毒、猪疱疹病毒1型、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒4种临床症状相似的病毒以及大肠埃希氏菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、锡那罗州弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯氏菌等细菌，通过观察结果，分析试纸条的特异性。

1.2.6 重复性试验 从同一批制备的试纸条中随机抽取4根试纸条，对阴性样品和高、中、低浓度的阳性样品进行检测，重复3次，考察试纸条的批内重复性。从3个不同批次制备的试纸条中，分别抽取4根对阴性样品和高、中、低浓度的阳性样品进行检测，考察试纸条的批间重复性。

1.2.7 稳定性试验 将同一批次的试纸条分别在4 ℃、室温和37 ℃条件下干燥避光保存，并分别在第7、14、21、56天，抽取6根试纸条，对阴性和不同浓度阳性样品进行检测(稀释倍数分别为1∶10，1∶50，1∶100，1∶300，1∶500)，此后每3个月重复此操作，进行稳定性试验。

1.2.8 临床样品的检测 用灭菌棉拭子蘸取粪便临床样品，于1 mL样品稀释液中，5 000 r/min离心10 min，取上清，用制备的胶体金试纸条，对50份临床样品进行检测。

2 结果

2.1 胶体金颗粒的表征

柠檬酸钠还原法和Tris辅助法制备胶体金溶液表征如图1所示，其中图1A和图1B图表明，采用上述两种方法制备的金溶液，分别呈紫红色和清澈透亮的酒红色。图1C和图1D图表明，Tris辅助法所制备的胶体金，颗粒大小均匀，呈圆球状；柠檬酸钠还原法制备的胶体金，颗粒大小不一，呈椭圆形。图1E图表明，Tris辅助法制备胶体金，粒径集中40 nm。图1F图表明，Tris辅助法制备胶体金，紫外吸收峰波长为520 nm。

A.柠檬酸钠还原法制备的胶体金溶液颜色；B.Tris辅助法制备的胶体金溶液颜色；C.柠檬酸钠还原法制备的胶体金透射电镜图(30 000×)；D.Tris辅助法制备的胶体金透射电镜图(30 000×)；E.Tris辅助法制备的胶体金粒径图；F.Tris辅助法制备的胶体金紫外可见吸收图谱

2.2 胶体金最适标记pH的确定

如图2结果显示，当1 mL胶体金溶液中添加2 μL K2CO3(0.1 mol/L)时，C、T线最清晰，膜面干净，无假阳性。当1 mL胶体金溶液中添加4 μL K2CO3(0.1 mol/L)时，金溶液滞留表面，膜面呈浅红色。根据C、T线显色程度及膜面干净程度，后续试验选择1 mL胶体金溶液中添加2 μL K2CO3。

2.3 胶体金最适标记蛋白浓度的确定

如图3结果显示，当1 mL胶体金溶液中加入2.5 μg Ab2抗体时，膜面不干净，有胶体金沉积。当1 mL胶体金溶液中加入5 μg Ab2抗体时，膜面干净，C、T线最清晰，后续试验选择1 mL胶体金溶液中添加5 μg Ab2抗体。

2.4 胶体金免疫层析试纸条的灵敏度

如图4检测结果显示，阳性样品稀释倍数为1∶10时，C、T线显色清晰，肉眼可观测到最低稀释倍数为1∶400。当浓度低于稀释倍数1∶400时，在自然光线下无法观察到检测线。

2.5 胶体金免疫层析试纸条的特异性

如图5检测结果显示，试纸条检测阳性样品，T线清晰明显。而猪传染性胃肠炎病毒、猪疱疹病毒1型、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、大肠埃希氏菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、锡那罗州弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌和肺炎克雷伯氏菌的样品检测呈阴性，表明该试纸条具有较高的特异性。

A.阴性对照；B.阳性对照；1～6.0、1、2、4、8、10 μL K2CO3

A.阴性对照；B.阳性样品；1～5.0、2.5、5、7.5、10 μg Ab2

2.6 胶体金免疫层析试纸条的重复性

同批次中的试纸条，对阴性样品及高、中、低浓度的阳性样品进行检测，如图6和图7所示，可见不同试纸条的C线、T线显色程度基本一致。从批次1、批次2、批次3，分别抽取4根对阴性样品及高、中、低浓度的阳性样品进行检测，不同试纸条的C线、T线显色程度基本一致。

2.7 胶体金免疫层析试纸条的稳定性试验

试纸条分别于4 ℃、室温和37 ℃条件下干燥避光保存，第40天抽取不同保存条件下的试纸条，并对阴性和不同浓度的阳性样品(稀释倍数为1∶10，1∶50，1∶100，1∶300，1∶500)进行检测，如图8显示，4 ℃保存的试纸条，C线、T线显色明显，膜面干净，37 ℃和常温保存的试纸条，C线、T线显色明显，但显色效果无4 ℃明显。

1.阴性对照；2.阳性对照；3～10.阳性样品的稀释倍数分别为1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶1 000

1.阴性对照；2.阳性对照；3～15.猪传染性胃肠炎病毒、猪疱疹病毒1型、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、大肠埃希氏菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、锡那罗州弧菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、奇异变形杆菌、无乳链球菌、肺炎克雷伯氏菌

2.8 胶体金免疫层析试纸条的临床试验

采用制备的试纸条和常规RT-PCR方法，对已知背景的30例轮状病毒临床阳性样本和20例阴性样本进行检测，结果如表1所示，2种方法阳性符合率、阴性符合率与总符合率均为100%，这说明本试验制备的胶体金免疫层析试纸条比较可靠。

1.阴性对照；2.高浓度阳性样品；3.中浓度阳性样品；4.低浓度阳性样品

1.阴性对照；2.高浓度阳性样品；3.中浓度阳性样品；4.低浓度阳性样品

1.阴性对照；2～6.阳性样品稀释倍数分别为1∶10、1∶50、1∶100、1∶300、1∶500

表1 胶体金免疫层析试纸条与RT-PCR对临床样品的检测结果比较

3 讨论

猪轮状病毒是导致哺乳仔猪和断奶仔猪腹泻的主要原因之一，给全球的养猪业造成了巨大的经济损失，且为人畜共患的腹泻病毒，通过粪-口途径传播，感染肠道肠上皮细胞，临床症状为腹泻、呕吐、厌食、脱水[13-14]。近年来,胶体金检测技术逐步兴起，基于其快速、特异、不受场地限制、操作无需专业技术人员的优势，该技术已广泛应用于多个领域。其中，胶体金的质量至关重要，形状不均一的胶体金颗粒会影响标记的效果、检测性能及其重复性。蛋白被标记的不均一会导致标记的胶体金积聚与凝集，即便立即将标记好的胶体金干燥于金标垫上，也会由于金颗粒形状的不规则导致其表面标记的蛋白易于脱落，造成检测结果的假阳性和不稳定性。

本研究通过改良标记胶体金的制备方法，制备优质胶体金，构建了一种基于Tris辅助法制备胶体金的猪轮状病毒免疫层析快速检测方法，用于粪便样本中轮状病毒的快速检测。结果表明，柠檬酸钠还原法制备的胶体金，颗粒大小不一，呈椭圆状；Tris辅助法制备的胶体金，胶体金颗粒大小均匀，呈球状，更利于金颗粒与抗体的偶联，且从紫外扫描仪和粒径仪的数据呈现，确定制备的胶体金质量佳，更加适用于检测方法的建立。此外，该试纸条最小检出稀释倍数为1∶400，表明该试纸条灵敏性良好。此外，该试纸条与猪传染性胃肠炎病毒、猪疱疹病毒1型、猪流行性腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒4种临床症状相似的病毒和常见的细菌均无交叉反应，具有很高的特异性。而且，试纸条在4 ℃、室温和37 ℃条件下，保存40 d，无假阳性，对高、中、低浓度的阳性样品的检测，T线显色清晰，具有良好的稳定性。猪轮状病毒胶体金免疫层析试纸条的重复性良好，从同一批次和不同批次随机抽取试纸条，C线、T线清晰明显。本文研制的胶体金免疫层析试纸条，对临床样品的检测结果与PCR检测结果的符合率为100%。因此，本研究通过Tris辅助法制备的优质胶体金，与柠檬酸钠还原法制备的胶体金相比，更适用于胶体金免疫层析试纸条的构建，提升试纸条各方面的性能，具有普适性，对其它胶体金试纸条的构建具有一定的参考意义。同时，基于Tris辅助法构建胶体金的猪轮状病毒免疫层析试纸条，适用于临床粪便样品中轮状病毒的快速检测，在轮状病毒性腹泻疾病的快速诊断和流行病学研究中具有广阔的应用前景。

本文研制了一种基于Tris辅助法制备胶体金的猪轮状病毒免疫层析快速检测方法，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、简单快捷等特点，可实现对临床样品的快速检测，适用于轮状病毒性腹泻疾病的快速诊断和流行病学调查。