D-氯前列醇钠在奶牛体内的药代动力学研究

李 香，李青云，张 欣，唐 熙，侯佳琪，辛怡霖，李引乾*

(1.陕西省动物疫病预防控制中心，陕西西安 710016；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

近年来,我国奶牛养殖模式不断转型升级， 养殖技术水平不断提高,全国奶牛养殖规模化率已达50%,现代化发展成果显著[1]。然而高产奶牛的繁殖性能却呈现不断下降的趋势,具体表现为发情时间延后或发情表现弱、空怀天数增加、人工授精情期受胎率降低和产犊间隔延长等[2]。D-氯前列醇钠(D-cloprostenol sodium)为人工合成的前列腺素(PGF2α)的类似物，能够有效溶解功能性黄体和病理性黄体[3-4]，增强子宫平滑肌的收缩舒张节律的作用，可用于治疗持久黄体、黄体囊肿而引起的不发情，同期发情、发情调控，引产、流产等分娩控制，母畜产后护理、产后子宫内膜炎防治及促进卵巢、子宫修复等疾病[5-7]。为全面了解D-氯前列醇钠在奶牛体内的药动学特征，参照《兽药试验技术规范汇编·兽药药物动力学试验技术规范》[8]，以肌肉注射给药的方式，应用高效液相法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定血清中D-氯前列醇钠浓度[9]，用3P97软件拟合药时曲线，计算药物动力学参数，以期为兽医临床合理用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物 中国荷斯坦成年奶牛6头，7岁～8岁，由杨陵区孟家寨奶牛养殖小区提供。试验期间常规饲养。

1.1.2 药品与试剂 D-氯前列醇钠注射液，宁波第二激素厂产品；乙腈，AR级，天津市科密欧化学试剂有限公司产品；甲醇、磷酸二氢钠，AR级，天津市天力化学试剂有限公司产品；无水乙醇，AR级，四川西陇科学有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 高效液相色谱仪，日本日立有限公司产品； Welchrom-C18色谱柱，美国Welch公司产品；1-15K低温高速离心机，Sigma公司产品；80-2离心机，上海手术器械厂产品；漩涡振荡器(QL-901)，其林贝尔仪器制造公司产品；DRAGON可调微量移液器，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 流动相为乙腈-2.4 mg/mL磷酸二氢钠(35∶65，V/V)；流速1.5 mL/min；固定相为Welchrom-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；柱温20 ℃；进样量为20 μL；紫外检测波长220 nm。

1.2.2 给药方法及采血时间 每头奶牛单剂量肌肉注射D-氯前列醇钠0.15 mg。奶牛给药前禁食12 h，自由饮水。每头奶牛于给药前采集空白对照血液5 mL。给药后0.083 3、0.166 7、0.25、0.333 3、0.5、0.75、1、1.333 3、1.666 7、2、2.5、3、4、5、6、8、10、12、16、24 h各采血1次，每次采血5 mL。

1.2.3 血清制备 将采集的血液置于试管中，放置成斜面，放入37 ℃温箱中作用30 min，再置4 ℃冰箱作用30 min，在转速4 000 r/min下离心5 min，取上层血浆，置于-20 ℃冰箱保存，1周内测定完毕。

1.2.4 标准曲线绘制 取D-氯前列醇钠标准品，分别以待测6只奶牛的空白血清作为稀释液，稀释配制成6组浓度分别为160、80、40、20、10、5.0、2.5、0 ng/mL的D-氯前列醇钠标准品溶液，进行HPLC测定。以D-氯前列醇钠浓度(x)为横坐标，以D-氯前列醇钠峰面积(y)为纵坐标，绘制奶牛空白血浆中D-氯前列醇钠的标准曲线，得回归方程。

1.2.5 精密度测定 取空白血浆3份，加入D-氯前列醇钠标准品配制80、20、2.5 ng/mL高、中、低浓度的D-氯前列醇钠血浆样品，进行HPLC检测分析。分别于同日内对每个浓度样品测定3次，即得日内精密度；1周内隔天测定，共测定3次，即得日间精密度。

1.2.6 回收率测定 取空白血浆3份，加入D-氯前列醇钠标准品配制2.5、20、80 ng/mL低、中、高浓度的D-氯前列醇钠血浆样品，进行HPLC检测分析。测定其保留时间，采用标准曲线计算血药浓度，计算其回收率。

1.2.7 血清D-氯前列醇钠质量浓度测定 以1.2.4建立的血样测定方法测定血药浓度。

1.2.8 药物动力学参数计算 用3P97软件逐只奶牛拟合药时曲线，计算药时曲线及药动学参数[10]。

2 结果

2.1 标准曲线的绘制

根据1.2.4的测定结果，制作的1～6号奶牛的标准曲线分别如下：

1号奶牛：标准物的浓度x与OD值y进行线性回归，标准曲线方程为：y=26 050x+3 215 336(R2=0.997)。由此可见，D-氯前列醇钠在0～160 ng/mL浓度范围内，线性关系良好(图1)。

2号奶牛：标准物的浓度x与OD值y进行线性回归，标准曲线方程为：y=26 121x+3 154 706 (R2=0.996)。由此可见，D-氯前列醇钠在0～160 ng/mL浓度范围内，线性关系良好。

3号奶牛：标准物的浓度x与OD值y进行线性回归，标准曲线方程为：y=25 708x+3 076 359 (R2=0.993)。由此可见，D-氯前列醇钠在0～160 ng/mL浓度范围内，线性关系良好。

4号奶牛：标准物的浓度x与OD值y进行线性回归，标准曲线方程为：y=25 694x+5 080 718 (R2=0.991)。由此可见，D-氯前列醇钠在0～160 ng/mL浓度范围内，线性关系良好。

5号奶牛：标准物的浓度x与OD值y进行线性回归，标准曲线方程为：y=26 579x+3 264 146 (R2=0.997)。由此可见，D-氯前列醇钠在0～160 ng/mL浓度范围内，线性关系良好。

6号奶牛：标准物的浓度x与OD值y进行线性回归，标准曲线方程为：y=26 214x+3 301 527 (R2=0.998)。由此可见，D-氯前列醇钠在0～160 ng/mL浓度范围内，线性关系良好。

图1 1号奶牛D-氯前列醇钠标准曲线

2.2 精密度的测定结果

测定结果(表1)表明，血浆中D-氯前列醇钠高(80 ng/mL)、 中(20 ng/mL)低(2.5 ng/mL)3种浓度的日内精密度和日间平均精密度均小于5%，符合要求，表明该方法稳定，适合测定D-氯前列醇钠血药浓度。

表1 血浆中D-氯前列醇钠的精密度测定结果

2.3 回收率的测定结果

测定结果(表2)表明，血浆中D-氯前列醇钠高(80 ng/mL)、 中(20 ng/mL)低(2.5 ng/mL)3种浓度的回收率均大于96%，说明该方法准确性较高，符合药物动力学实验试求。

表2 血浆中D-氯前列醇钠的回收率测定结果

2.4 奶牛血清中D-氯前列醇钠的实测值及血浆药品检测的色谱图

奶牛空白血浆样品、D-氯前列醇钠标准品以及待测血清样品进行HPLC测定，测定色谱图分别见图2A、图2B和图2C。测定结果显示，D-氯前列醇钠保留时间为3 min左右，D-氯前列醇钠与血清基质分离良好，血浆内源性杂质对D-氯前列醇含量的测定无干扰，可以满足测定需要。

A.奶牛空白血浆；B.D-氯前列醇钠标准品；C.实测血浆样品

2.5 牛体内血药质量浓度测定值

6头奶牛血清中D-氯前列醇钠浓度测定结果见表3。

2.6 药-时曲线与药物动力学参数

用3P97软件拟合药时曲线，计算药物动力学参数。结果表明，单剂量快速肌肉注射D-氯前列醇钠后，D-氯前列醇钠的药时数据均符合有吸收因素一室模型。根据药-时曲线，计算D-氯前列醇钠在奶牛体内的药物动力学参数。结果见表4。由表4可知，D-氯前列醇钠在奶牛体内的药物动力学参数消除相半衰期t1/2kel、药-时曲线下面积AUC、消除速率常数Kel、峰浓度Cmax和达峰时间Tmax分别为(4.528±0.803)h、(581.400±216.838)ng·mL-1·h、(0.158±0.029)h-1、(71.172±32.440)ng·mL-1、(1.600±0.164)h。

表3 奶牛注射D-氯前列醇钠的血药质量浓度

表4 D-氯前列醇钠在奶牛体内的药物动力学参数

3 讨论

采用高效液相色谱法，以乙腈-2.4 mg/mL磷酸二氢钠(35∶65，V/V)为流动相，固定相为Welchrom-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测波长为220 nm，进样量为20 μL，测定D-氯前列醇钠标准品标准曲线，其线性关系良好，日内精密度和日间精密度均小于5%，平均回收率为(97.830±0.925)%，由此可见该方法简单、快速、准确、灵敏度高。可用于血液样品D-氯前列醇钠含量的测定，为研究其在奶牛体内药物动力学研究提供可靠保证。

药动学参数是反映药物在体内动态变化规律性的一些常数，是评价兽药质量的重要指标之一[11]。试验结果显示，奶牛肌肉注射后，D-氯前列醇钠在奶牛体内的药代动力学配置符合有吸收因素一室模型特征[12]。消除相半衰期t1/2ke为(4.528±0.803)h，消除相半衰期t1/2kel是指血药浓度下降一半所需时间，提示奶牛肌肉注射D-氯前列醇钠后，药物在体内的消除比较快。消除速率常数Kel为(0.158±0.029 3)h-1，药-时曲线下面积AUC为(581.400±216.838)ng·mL-1·h，药时曲线下面积AUC是血药浓度曲线对时间轴所包围的面积，是评价药物吸收程度的重要指标，提示D-氯前列醇钠在奶牛体内吸收良好。峰浓度Cmax为7(1.172±32.440)ng·mL-1，达峰时间Tmax为(1.600±0.164)h，达峰时间Tmax反映药物进入体内的速度提示肌肉注射药物后，其吸收速度较快。

本研究利用高效液相色谱法考察了D-氯前列醇钠在奶牛体内的药物动力学特征，奶牛肌注D-氯前列醇钠注射液后，其吸收迅速，消除较快。研究结果为D-氯前列醇钠的临床使用提供了试验依据。