葛黄颗粒的质量标准研究

黄宇思 李能源 魏 嵋 黄 锐 蒲清荣 罗 群▲

1.西南医科大学附属中医医院药学部，四川泸州 646000；2.西南医科大学附属中医医院肝胆病科，四川泸州 646000

葛黄颗粒是在西南医科大学附属中医医院（我院）孙同郊教授的有效经验方的基础上研制而成。由葛花、党参、虎杖、山楂、柴胡、盐泽泻、枳椇等组成，具有清热解毒、除湿、疏肝健脾的功效。临床上用于酒精及其他原因引起的慢性肝炎和脂肪肝。为了有效控制葛黄颗粒的质量，采用薄层色谱法（thinlayer chromatography，TLC）对党参、丹参、白芍、虎杖进行鉴别，采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定君药葛花中射干苷的含量，以期建立有效质量控制方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器与设备

高效液相色谱仪（日本岛津，型号：LC-20A）；超声波提取器（武汉嘉鹏电子有限公司，型号：JPCT0328）；电子天平（常州市幸运电子设备有限公司，型号：JA-SERIES）；电子天平（日本岛津，型号：AUW120D）；薄层色谱成像系统（上海科哲生化科技有限公司，型号：GOODLOOK-1000）。

1.2 药品与试剂

射干苷（批号：111632-200602，含量：100%，供含量测定用）、芍药苷（批号：110736-201539，含量：96.4%）、丹参素钠（批号：110855-201311，含量：98.1%）、大黄素（批号：110756-201512，含量：98.7%）、党参对照药材（批号：121057-201206），由中国食品药品检定研究院提供；色谱乙腈、色谱甲醇、娃哈哈纯净水等其余试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 白芍TLC鉴别

2.1.1 供试品溶液的制备 取葛黄颗粒10 g，加50 ml乙醇，回流1 h，滤过，蒸去乙醇，加30 ml水溶解，用水饱和正丁醇提取2次，每次30 ml，合并提取液，用5 ml氨试液洗涤，再用正丁醇饱和的水洗涤2次，每次20 ml，取正丁醇液，蒸干，加乙醇1 ml溶解，即得。

2.1.2 对照品溶液的制备 取芍药苷，以乙醇为溶剂，制成1 mg/ml的对照品溶液。

2.1.3 阴性样品溶液的制备 取葛黄颗粒缺白芍阴性样品，按照“2.1.1”项下的方法制备阴性样品溶液。

2.1.4 试验方法 吸取“2.1.1”项下的供试品溶液、“2.1.2”项下的对照品溶液、“2.1.3”项下的阴性样品溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，喷5%香草醛硫酸溶液，105℃加热显色。

2.1.5 试验结果 供试品色谱中，检出芍药苷的斑点，阴性无干扰。见图1。

图1 葛黄颗粒中白芍TLC图

2.2 丹参TLC鉴别

2.2.1 供试品溶液的制备 取葛黄颗粒10 g，加50 ml甲醇，回流30 min，滤过，蒸去甲醇，加25 ml水溶解，用稀HCl调pH至2，用乙酸乙酯萃取2次，每次20 ml，合并提取液，蒸干，加甲醇1 ml溶解，即得。

2.2.2 对照品溶液的制备 取丹参素钠，以甲醇为溶剂，制成1 mg/ml的对照品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 取葛黄颗粒缺丹参阴性样品，按照“2.2.1”项下的方法制备阴性样品溶液。

2.2.4 试验方法 吸取“2.2.1”项下的供试品溶液10 μl、“2.2.2”项下的对照品溶液5 μl、“2.2.3”项下的阴性样品溶液10 μl，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶5∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置氨蒸气中熏15 min，放置，在紫外灯（365 nm）下检视。

2.2.5 试验结果 供试品色谱中，检出丹参素钠的斑点，阴性无干扰。见图2。

图2 葛黄颗粒中丹参TLC图

2.3 虎杖TLC鉴别

2.3.1 供试品溶液的制备 取葛黄颗粒10 g，加50 ml甲醇，浸泡1 h，滤过，蒸去甲醇，加水25 ml溶解，再加盐酸3 ml，回流30 min，冷却，用乙醚提取2次，每次20 ml，合并提取液，蒸干，残渣加三氯甲烷1 ml溶解，即得。

2.3.2 对照品溶液的制备 取大黄素，以甲醇为溶剂，制成1 mg/ml的对照品溶液。

2.3.3 阴性样品溶液的制备 取葛黄颗粒缺虎杖阴性样品，按照“2.3.1”项下的方法制备阴性样品溶液。

2.3.4 试验方法 吸取“2.3.1”项下的供试品溶液、“2.3.2”项下的对照品溶液、“2.3.3”项下的阴性样品溶液各10 μl，点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（15∶2∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯（365 nm）下检视。

2.3.5 试验结果 供试品色谱中，检出大黄素的斑点，阴性无干扰。见图3。

图3 葛黄颗粒中虎杖TLC图

2.4 党参TLC鉴别

2.4.1 供试品溶液的制备 取葛黄颗粒10 g，加100 ml水和6 ml盐酸，置电炉上加热微沸30 min，滤过，用乙醚提取2次，每次25 ml，合并提取液，蒸干，残渣加乙醇2 ml溶解，即得。

2.4.2 对照药材溶液的制备 取党参对照药材1 g，按照“2.4.1”项下的方法制备对照药材溶液。

2.4.3 阴性样品溶液的制备 取葛黄颗粒缺党参阴性样品，按照“2.4.1”项下的方法制备阴性样品溶液。

2.4.4 试验方法 吸取“2.4.1”项下的供试品溶液5 μl、“2.4.2”项下的对照药材溶液10 μl、“2.4.3”项下的阴性样品溶液5 μl，点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸（10∶7∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，喷10%硫酸乙醇溶液，105℃加热显色。

2.4.5 试验结果 供试品色谱中，检出党参对照药材的斑点，阴性无干扰。见图4。

图4 葛黄颗粒中党参TLC图

2.5 射干苷HPLC鉴别

2.5.1 色谱条件 色谱柱：Shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-0.2%磷酸（15∶85）；流速：1 ml/min；波长：265 nm；柱温：40℃。

2.5.2 对照品溶液 取14.01 mg射干苷，加70%乙醇制得浓度为0.5604 mg/ml的溶液，备用。精密量取射干苷备用液0.4 ml，加70%乙醇稀释至10 ml，摇匀，制得浓度为22.42 μg/ml的对照品溶液。

2.5.3 供试品溶液 精密称取葛黄颗粒2.0 g，置圆底烧瓶中，加50 ml水，称定重量，回流30 min，放冷，称重，补足重量，摇匀，滤过，通过0.22 μm微孔滤膜，即得。

2.5.4 阴性样品溶液 精密称取缺葛花样品2.0 g，按“2.5.3”项下方法制得阴性样品溶液。

2.5.5 专属性考察 取“2.5.2”“2.5.3”“2.5.4”项下溶液10 μl，按“2.5.1”项下色谱条件测定。结果显示，葛黄颗粒供试品溶液可以检出射干苷色谱峰，分离度良好，且阴性无干扰。见图5。本方法专属性良好。

图5 葛黄颗粒HPLC图谱

2.5.6 线性关系考察 精密称取射干苷14.01 mg，加70%乙醇制成浓度为0.5604 mg/ml射干苷贮备液。分别精密量取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4 ml射干苷贮备液定容至10 ml，分别制成浓度为5.60、11.21、22.42、44.83、89.66、179.33、358.66 μg/ml的溶液。按“2.5.1”项下色谱条件测定，以峰面积（A）为纵坐标（Y），射干苷浓度（μg/ml）为横坐标（X），得到回归方程：Y=41 165X+20 654，r2=0.9993（n=7）。

2.5.7 精密度 取“2.5.2”项下射干苷溶液（浓度：22.42 μg/ml）10 μl，连续进样，共6次，得RSD为1.32%（n=6）。表明精密度符合要求。

2.5.8 重复性 取葛黄颗粒6份，每份2.0 g，精密称定，按“2.5.3”项下方法制备供试品溶液，测定，得RSD为0.11%（n=6）。表明分析方法重复性良好。

2.5.9 稳定性 取葛黄颗粒2.0 g，精密称定，按“2.5.3”项下方法制成供试品溶液，立即测定，再于室温放置2、4、6、8、12、24 h进样，记录峰面积。结果RSD为1.07%。表明本品稳定性良好。

2.5.10 加样回收率 取葛黄颗粒9份，各1.0 g，精密称定，每三份为一组，分别加入射干苷对照品溶液（浓度为0.589 mg/ml）1.0、2.0、3.0 ml，按“2.5.3”项方法制备供试品溶液，按“2.5.1”项下色谱条件测定，计算加样回收率。结果射干苷平均回收率为101.19%，RSD为1.50%。见表1。表明本方法准确可靠。

表1 加样回收率结果

2.5.11 样品的含量 测定3批葛黄颗粒（批号：20200122、20200123、20200124），按“2.5”项下方法制备、测定，计算其含量。结果三批样品中射干苷分别为1.17、1.16、1.09 mg/g，平均含量为1.14 mg/g。制剂中指标性成分的含量按80%设限，初步拟订葛黄颗粒中射干苷的含量不得少于0.9 mg/g，各批样品含量均符合要求。

3 讨论

3.1 薄层鉴别

采用TLC对白芍、丹参、党参、虎杖进行定性鉴别，结果斑点清晰，分离度好，专属性强，可以作为葛黄颗粒质量控制方法。

对于丹参的薄层鉴别，水溶性成分丹酚酸B因其光热不稳定、易降解、易氧化的特性，所以未选择丹酚酸B进行鉴别[1]。而丹参的水提液中酚酸类物质丹参素，常以钠盐形式存在，所以选择丹参素钠来鉴别葛黄颗粒中的丹参。在研究中发现，在薄层色谱显色时，置氨蒸气中熏后，放置检视，发现薄层斑点受气温、放置时间等因素影响，因此冬天环境温度较低时，薄层显色时可以适当延长放置时间，升高环境温度使斑点更清晰。

文献报道，大黄素对脂肪肝有一定的防治作用[2-3]；白芍可以减少肝细胞水肿和坏死，减轻肝细胞病变程度，保护酒精性肝损伤[4]。因此，选择虎杖（大黄素）、白芍（芍药苷）进行鉴别。结果虎杖、白芍薄层色谱斑点清晰，且阴性样品无干扰，可以作为葛黄颗粒的鉴别指标。

对于葛黄颗粒中其他药味，盐泽泻其主要成分23-乙酰泽泻醇B，遇热转化成泽泻醇A[5]；柴胡其主要活性成分为柴胡皂苷，柴胡皂苷d进入煎液后有可能转化为柴胡皂苷b2[6]；赶黄草（含熊果酸、没食子酸、槲皮素）[7-8]，与处方中药味山楂（含熊果酸）[9]、白芍（含没食子酸）[10]、虎杖（含槲皮素）[11]，可能会相互影响，阴性出现干扰；白术薄层色谱阴性有干扰。综上，没有选择盐泽泻、柴胡、赶黄草、山楂、白术作为葛黄颗粒的鉴别指标，须进一步研究。

3.2 含量测定

葛黄颗粒中君药葛花，是我国传统解酒中药，具有较强的解酒保肝作用，临床应用常为解酒制剂的主要原料。葛花中黄酮类成分含量最高，也是葛花的主要活性成分，包括射干苷、葛花苷、次葛花苷、鸢尾黄素等[12]。现代药理作用表明，葛花具有解酒护肝、影响乙醇吸收代谢、调节血糖血脂等作用[13]。射干苷作为葛花主要活性成分之一，性质稳定，适于作为含量测定指标[14]；其他黄酮类成分受产地等因素影响，含量差异较大。因此，葛黄颗粒选择射干苷作为含量测定指标。

本研究比较了不同比例流动相对峰型、分离度的影响，如乙腈-0.2%磷酸（20∶80）[15]、乙腈-0.2%磷酸（17∶83）、乙腈-0.2%磷酸（15∶85），最终确定流动相为乙腈-0.2%磷酸（15∶85）时射干苷峰型及分离度较好。同时供试品溶液制备方法考察结果表明，回流提取方法优于超声提取，且30 min即可提取完全。

本研究建立了葛黄颗粒党参、丹参（丹参素钠）、白芍（芍药苷）、虎杖（大黄素）的薄层鉴别方法及主要有效成分射干苷的含量测定方法，可用于该制剂质量控制。