蒲地金黄贴质量标准的研究

安俏颜 陈震尧▲ 邓礼荷 夏静文 刘 燕

1.广东省肇庆市中医院药剂科，广东肇庆 526020；2.肇庆医学高等专科学校药学系，广东肇庆 526020

蒲地金黄贴处方由黄柏、大黄、黄芩、栀子、侧柏叶、蒲公英、广地丁、紫苏叶8种药味组成，该制剂是根据肇庆市中医院（我院）临床经验方，通过制备工艺研究，全药粉与基质混合制成的贴膏剂，具有散瘀消肿、清热解毒的作用，适应证为跌打肿痛、热毒内蕴而见局部红肿热痛。

蒲地金黄贴作为研发的中药新制剂，其化学成分复杂、性质各不相同，尚未建立全面的质量内控指标，为有效控制该制剂的质量，对蒲地金黄贴的质量标准进行方法学研究[1]。选用薄层色谱法对蒲地金黄贴中黄芩、栀子开展定性鉴别；对大黄、黄柏、侧柏叶选用显微鉴别方法；盐酸小檗碱作为君药黄柏成分中的主要有效成分，具有抗炎、镇痛、抑菌、免疫调节、降血糖和血压等多种作用，高效液相色谱法具备分离速度快、选择性好、检测的灵敏度高等优点，因此选取该法测定盐酸小檗碱的含量[2-4]，以建立我院制剂室开发的医院制剂蒲地金黄贴的质量标准，为贴膏剂质量控制提供依据，现报道如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器

台式数控超声波清洗器（型号：KQ5200DE，频率：40 kHz，功率：200 W）；高效液相色谱仪（型号：Agilent 1260，美国Agilent公司）；真空泵（型号：AP-01P，天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；电子天平（型号：CPA225D，德国赛多利斯公司）；奥林巴斯CX31生物显微镜；多功能紫外分析仪（型号：ZF1-I，上海和勤分析仪器有限公司）。

1.2 试药

供 试 品 蒲 地 金 黄 贴（批 号：2021060901、2021060902、2021060903，由我院自制）、缺黄柏阴性样品、缺黄芩阴性样品、缺栀子阴性样品（我院制剂室自制）；试验用对照品（于中国食品药品检定研究院购入）：栀子苷（110749-201919）、盐酸小檗碱（110713-200911）、黄芩苷（110715-201815）；水为纯化水，薄层层析硅胶板（10 cm×20 cm）；乙腈为色谱纯，甲醇、正丁醇等试剂均为分析纯。

2 显微鉴别

取蒲地金黄贴适量，涂片，置显微镜下观察：石细胞颜色呈鲜黄色，层纹明显，壁厚，分枝状，纤维束鲜黄色，周围细胞含草酸钙方晶，形成晶纤维（黄柏），草酸钙簇晶（大黄）大，直径60～140 mm；气孔可见，黄绿色，凹陷型，保卫细胞较大，侧面观呈哑铃状（侧柏叶）[5-7]，见图1。

图1 蒲地金黄贴显微特征图

3 薄层色谱鉴别

3.1 黄芩薄层色谱鉴别

取供试品蒲地金黄贴1贴，除去背衬和盖衬，称取10 g，加水60 ml，摇匀，超声处理30 min，离心，取上清液，滤过，滤液蒸至约30 ml，放冷，石油醚（每次30 ml）洗涤2次，弃去石油醚液，用盐酸调pH至2，每次用乙酸乙酯30 ml提取，共2次[8]，将提取所得的乙酸乙酯液合并后蒸干，加入1 ml甲醇液溶解残渣，所得液作为供试品溶液。按照上述同样的方法制备相同处方比例缺黄芩的阴性对照溶液[9]。另称取黄芩苷对照品，加适量甲醇制成每1 ml含5 mg黄芩苷对照品的溶液。依照薄层色谱法进行试验，吸取上述三种溶液，分别点于同一硅胶G薄层板上，点样量为各3 μl，以乙酸丁酯-甲酸-水（7∶3∶2）的上层溶液为展开剂，展开高度为9 cm，取出，晾干后取3%三氯化铁乙醇溶液适量喷在薄层板上。结果显示，供试品在与对照品色谱相应位置上显相同颜色的斑点，阴性无干扰。见图2A。

3.2 栀子薄层色谱鉴别

取本品1贴，除去背衬和盖衬，称取10 g，加50%甲醇溶液60 ml溶解，离心，取上清液过滤并蒸干，加水30 ml溶解残渣，每次用石油醚30 ml洗涤，共2次，将石油醚液弃去，所得溶液用水饱和的正丁醇30 ml依次提取2次，将正丁醇液合并后蒸干，加入2 ml甲醇液溶解残渣，作为供试品溶液。按照上述同样的方法制备相同处方比例缺栀子的阴性对照溶液。另取适量甲醇加入称量好的栀子苷对照品，制成每1 ml含5 mg栀子苷对照品的溶液。依照薄层色谱法进行试验，吸取上述对照品溶液2 μl、供试品溶液3 μl、阴性对照溶液3 μl、分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（5∶5∶1∶1）为展开剂，展开高度为8 cm，取出后晾干，取适量10%硫酸乙醇溶液喷在薄层板上，随后加热至斑点显色清晰，结果显示，供试品在与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，阴性无干扰[10-12]。见图2B。

图2 蒲地金黄贴薄层色谱图

4 含量测定

4.1 色谱条件

色 谱 柱（型 号：Agilent ZORBAX-SB-C18），进样量5 μl，检测波长：265 nm，0.1%磷酸溶液-乙腈体积比例为50∶50为流动相（每100 ml溶液加十二烷基磺酸钠0.1 g），柱温：30℃。

4.2 供试品溶液的制备

精密称定本品约7.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入混合溶液盐酸-甲醇（1∶100）50 ml，称定其重量，进行时长为30 min的超声，待冷却后再次称定重量，取用混合溶液盐酸-甲醇（1∶100）适量补足减失的重量，取2 ml移至5 ml干净的容量瓶后用流动相定容至刻度即可，过滤用微孔滤膜（孔径：0.45 μm），取续滤液，即得。

4.3 对照品溶液制备

取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定后加入甲醇溶解制成贮备液（每l ml含0.25 mg）。于10 ml干净量瓶中加入精密量取的1 ml贮备液，并加入流动相定容至刻度，摇匀，过滤用微孔滤膜（孔径：0.45 μm），即得对照品溶液（每l ml含25 μg）。

4.4 阴性对照样品溶液的制备

依照本品的制备工艺和处方配比制成缺黄柏的阴性样品，再依照上述4.2项下供试品溶液制备方法制得阴性对照溶液[13]。

4.5 专属性试验

分别依次精密吸取阴性对照样品溶液、对照品溶液、供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行测定，吸取量均为5 μl，结果显示阴性对照在相同位置无色谱峰，对测定无干扰，对照品对比供试品，在相同位置有色谱峰，盐酸小檗碱与其他成分的色谱峰分离度＞1.5[14-16]。对照品、供试品、阴性对照图谱分别见图3。

图3 高效液相色谱法色谱图

4.6 线性范围考察

吸取对照品溶液12.5、25.0、50.0、125.0、250.0、375.0、500.0 ng，按照4.1项下的色谱条件进行注入样品测定，取不同的进样量作为横坐标，取进样量的峰面积作为纵坐标，进行线性回归分析，结果盐酸小檗碱进样量在12.5～498.4 ng内，线性关系考察为良好[17]，回归方程为：Y=118.33X-6.44，r=1.0000。

4.7 仪器精密度试验

吸取对照品溶液，连续进样6次测定，每次的量均为5 μl，盐酸小檗碱峰面积RSD为0.63%，结果显示含量测定的仪器精密度为良好。

4.8 重复性试验

取供试品（批号：2021060901）6份，精密称定每份约7.0 g，依照4.2项下方法制得样品批次为2021060901的6份供试品溶液，依次进样测定，得出供试品中盐酸小檗碱的平均含量为4066 μg（n=6），RSD为0.52%，结果表明，该供试品溶液的制备方法重复性良好。

4.9 稳定性试验

同一供试品溶液（批号：2021060901）经精密吸取，分别在0、2、4、6、8、12 h各进样一次测定。测得12 h内盐酸小檗碱峰面积RSD为0.63%，表明在12 h内，供试品溶液稳定性呈现的结果为良好。

4.10 加样回收率试验

取已知含量的供试品（批号：2021060901）9份，精密称定，各约3.5 g，分为3组，每组3份，精密量取对照品1、2、3 mg分别加至每组样品中[18]，依照4.2项下方法制得9份供试品溶液，每份依次进样测定，每次5 μl，计算回收率，结果盐酸小檗碱回收率平均值为99.7%（n=9），RSD为1.69%，见表1。

表1 加样回收率试验结果（n=9）

4.11 样品含量测定

取3批次的蒲地金黄贴（批号：2021060901、2021060902、2021060903），供试品溶液依照4.2项下制备方法所得，每批供试品溶液依次进样测定，平行测3份，取平均值，根据外标法计算盐酸小檗碱含量，结果显示蒲地金黄贴平均每克中含量为565.18 μg，RSD为0.65%。按其含量下浮幅度20%计，则蒲地金黄贴每克含盐酸小檗碱含量限度可暂定为应不低于452.14 μg。

5 讨论

5.1 薄层鉴别的选择

本研究在薄层鉴别药味的选择上进行了预实验，分别按照《中国药典》[19]蒲公英、紫苏叶项下收载薄层鉴别方法试验，对照药材与供试品色谱在相对应的位置上并没有出现相同颜色的斑点。同时，在《中国药典》[19]以及相关的文献资料中，未找到有关广地丁的薄层色谱鉴别研究方法。

前期在对黄芩薄层色谱预实验研究中，曾选用展开剂甲苯-甲醇-乙酸乙酯-甲酸（10∶1∶3∶2）进行试验，显色剂为适量的3%三氯化铁乙醇溶液，虽然阴性对照无干扰，对照品与供试品色谱在相应位置上显相同颜色的斑点，但Rf值过低，分离度差。后调整显色剂和展开剂的组分，改为乙酸丁酯-水-甲酸（7∶2∶3），3%三氯化铁溶液作为显色剂，结果对照品与供试品在色谱上对应良好，且斑点清晰，分离度高，预饱和30 min效果更好。

5.2 流动相的选择

本研究考察了两种比例的流动相，前者为0.1%磷酸溶液-乙腈（55∶45），每100 ml溶液中加入十二烷基磺酸钠0.1 g，后者为0.1%磷酸溶液-乙腈（50∶50），每100 ml溶液加十二烷基磺酸钠0.1 g，结果表明后者比例流动相的分离度高、峰形更好。

5.3 提取方法的选择

本研究考察了两种提取方法，分别是供试品加入盐酸-甲醇（1∶100）的混合溶液后加热回流1 h和超声30 min，按照测定的含量显示，加热回流与超声处理测出的含量差别不大，但超声处理省时和操作简便，更适合作为本品的提取方法。

蒲地金黄贴处方由八味药材组成，方中君药为大黄、黄柏，其中黄柏具有通络、清热等功能；大黄则有凉血逐瘀的作用。黄芩、栀子、侧柏叶为臣药，其中黄芩外用可治疗痈肿疮疖等外科疾患；栀子外用于跌打损伤导致的肿痛；侧柏叶既可疗治筋骨折伤，又可破除瘀血癥瘕。蒲公英、广地丁合为佐药。在蒲地金黄贴的质量标准研究中，采用显微鉴别法和高效液相色谱法测定方中君药黄柏，选用显微鉴别法鉴定方中君药大黄和臣药侧柏叶，采用薄层色谱法鉴别方中臣药黄芩和栀子。

综上所述，本研究采用显微鉴别法鉴定出大黄、黄柏、侧柏叶，薄层色谱法对蒲地金黄贴中黄芩、栀子进行定性鉴别，采用高效液相色谱法测定蒲地金黄贴中的盐酸小檗碱含量，建立了蒲地金黄贴的质量标准。

通过查阅相关文献的研究结果进行分析比较[20-21]，有研究应用薄层色谱对黄芩、栀子、大黄、黄柏进行定性检测，有研究选用高效液相色谱法对黄芩苷、栀子苷、盐酸小檗碱等进行定量测定，也有研究实行单一药味多种检测方法的质控模式。由于每种中药制剂的组方与比例各不相同，且化学成分复杂，因此质量标准研究中要求阴性无干扰。本方法重复性好、无阴性干扰、准确简便、专属性强。

蒲地金黄贴作为中药制剂，成分复杂，增加质量内控指标能使制剂的质量更稳定、安全、有效。本研究选取高效液相色谱法测定黄柏中盐酸小檗碱的含量，测定成分单一，具有一定的局限性。黄柏作为本方的君药，除了盐酸小檗碱还有4种成分。一测多评法具有成本低、实用性强的优点，可尝试采用一测多评法的质控模式对五种生物碱进行含量测定，更全面地控制蒲地金黄贴质量。