基于网络药理学和生物信息学探讨夏天无治疗胃癌的机制

黄文安 何智博 刘 俊▲

1.九江学院医学院，江西九江 332005；2.九江学院外国语学院，江西九江 332005

夏天无为罂粟科紫堇属延胡索亚属植物伏生紫堇的块茎，主产于江西、湖南、福建、浙江、安徽等省份，以江西产质量为佳，具有活血通络、行气止痛的功效[1]。夏天无在临床上常用于治疗心脑血管系统疾病、腰椎间盘突出症、坐骨神经痛、风湿性关节炎等[2]。虽然夏天无的临床疗效显著，应用广泛，但其在癌症治疗中研究较少，对癌症的治疗也仅限于对胃癌疼痛有减轻效果[3]，并且不良反应率低。但是夏天无的药理学研究基础相对薄弱，尤其对其单体的抗癌活性及作用机制缺乏系统深入的研究。

中医药治疗和预防癌症在中国有着悠久的历史，因其在一定程度上能够协同增效和降低西药毒性而越来越受到人们的重视[4]。本研究运用网络药理学研究将传统的中草药与现代药理学、生物信息学、分子生物学相结合，探讨夏天无治疗胃癌的有效成分及潜在机制，可能为复杂中药的机制研究提供研究策略。

1 材料与方法

1.1 夏天无潜在成药成分及对应靶点的确定

利用中药系统药理学数据库（TCMSP）和分析平台（https: //old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）将口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18作为评价指标，筛选夏天无有效成分及对应靶点。中医药证候关联数据库和中医大百科全书（http: //www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/index.html）对靶点及对应的成分进行进一步合并筛选。Unitprot数据库（http: //www.Uniport.org/）用于翻译夏天无相关靶基因。

1.2 胃癌相关靶基因获取

将“gastric cancer”作 为 搜 索 关 键 词，在GeneCards数据库中进行检索，获得人类胃癌相关靶基因。

1.3 “夏天无有效成分-靶基因-胃癌”网络构建

利用Venny在线数据库（https: //bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）将1.1中获得的夏天无相关靶基因与1.2中获得的胃癌靶基因进行交互映射，获得交集基因。将夏天无有效成分、交集基因和胃癌相关信息导入到Cytoscape 3.7.2软件，构建“夏天无有效成分-靶基因-胃癌”网络。

1.4 靶蛋白与靶蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络的构建

利用STRING数据库（http: //string-db.org/）将1.3中获得的交集基因进行多蛋白相互作用分析，将“最低蛋白相互作用分值（minimum required interaction score）”设置为0.900，其余参数保持默认设置，构建PPI网络。利用Cytoscape 3.7.2软件对PPI网络进行进一步可视化分析，筛选关键靶点。

1.5 基因本体论（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG）代谢通路富集分析

将1.4中获得的关键靶点导入DAVID 6.8数据库基因信息列表，获得关键靶点的GO富集分析及KEGG代谢通路富集分析数据，将筛选条件设置为P＜ 0.01，FDR＜ 0.01，利用R软件对结果进行图表可视化分析。

1.6 夏天无靶基因与胃癌预后分析

进入GEPIA 2数据库，选择survival analysis，将1.3获得的交集靶基因依次进行预后分析，其中癌症类型选择胃腺癌（stomach adenocarcinoma），方法选择总生存期（overall survival，OS），其余为默认值，log rankP＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 夏天无潜在有效成分及靶点的获得

根据筛选条件获得6种夏天无有效成分（表1），对应67个靶点，其中65个与胃癌相关，72个靶基因。

表1 夏天无主要活性成分基本信息

2.2 胃癌相关靶基因

通过GeneCards数据库，获得胃癌相关基因11 842个。

2.3 “夏天无有效成分-靶基因-胃癌”网络图

Venn映射分析获得了65个药物与疾病的交集基因（图1），对应6种夏天无有效成分。“夏天无有效成分-靶基因-胃癌”网络中共有72个节点（有效成分6个，靶基因65个，疾病1种）和454条相互作用的边（图2）。

图1 Venn分析

图2 “中药化合物-作用靶点-疾病”网络

2.4 PPI网络分析

PPI网络中有共65个相互作用节点，139条相互作用连线（图3）。Cytoscape 3.7.2进一步可视化分析得到45个关键靶基因（图4），其中F2、CHRM1、HTR2A及ADRA1B等蛋白度值相对较高，ESR1与NCOA1，CALM1与CALM2、NOS2、CALM3、NOS3以及NCOA1与ESR2、RXRA、RXRB之间相互作用程度较高。

图3 PPI网络分析

图4 夏天无治疗胃癌关键靶基因网络

2.5 GO功能分析

GO富集分析结果显示，夏天无治疗胃癌的关键靶基因主要影响的前20位的功能信息如下（P＜ 0.01，FDR＜ 0.01）。生物过程方面：腺苷酸环化酶抑制G蛋白偶联乙酰胆碱受体信号通路、调节心肌收缩、磷脂酶C激活G蛋白偶联的乙酰胆碱受体信号通路等；分子功能方面：一氧化氮合酶调节剂活性、G蛋白偶联的乙酰胆碱受体活性、药物结合；细胞组成方面：质膜的组成部分、质膜、轴突末端等（图5）。

图5 GO功能富集分析柱状图

2.6 KEGG代谢通路富集分析

KEGG代谢通路富集分析发现，夏天无治疗胃癌的关键靶基因显著富集在18条通路上（P＜ 0.01，FDR＜ 0.01），见图6，其中有2条通路与胃癌关系密切。图表显示夏天无治疗胃癌主要影响的通路有钙信号通路、神经活性配体-受体相互作用等多条途径。

图6 KEGG代谢通路分析（P ＜ 0.01，FDR＜ 0.01）

2.7 夏天无靶基因与胃癌预后分析

使用GEPIA 2数据库进行胃癌预后分析发现ADRA1A、ADRA1B、AR、ESR1、F7、OPRD1、PTGS2、RXRA等基因的生存曲线的log rankP均＜0.05（图7），其中RXRA高表达的胃癌患者比RXRA低表达的胃癌患者中位生存期长，其余基因均为低表达水平时更能延长患者的中位生存时间。

3 讨论

本研究利用网络药理学方法借助相关数据库和软件对夏天无治疗胃癌的作用机制进行探讨。结果显示，夏天无治疗胃癌的6种有效成分主要是生物碱类。研究表明，生物碱具有良好的抗肿瘤活性。其中，bicuculline能有效抑制人肝癌MHCC97-H细胞的迁移和侵袭[5]，Fumarine通过刺激人结肠癌中的p53通路发挥抗增殖作用[6]，在用palmatine光动力处理后，HT-29细胞的凋亡率显著增加[7]。这6种有效成分对应的雄激素受体（androgen receptor，AR）[8]、细胞周期蛋白依赖性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）[9]、热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP 90）[10]和雌激素受体（estrogen receptor，ESR1）[11]等靶点均与胃癌治疗有关。有效的AR拮抗剂能够抑制AR信号传导进而抑制胃癌细胞的生长、迁移和侵袭[12]。CDK2的表达与胃癌的Borrmann分型和腹膜转移相关（P＜ 0.01）。另外，CDK2的表达还与胃癌浸润深度和淋巴结转移有关[13]。HSP 90α表达水平与临床病理学参数（包括患者存活率）之间的相关性，相比HSP 90α低表达组，HSP 90α高强度表达组肿瘤体积较大且肿瘤浸润更明显。高HSP 90α表达水平也与淋巴浸润、淋巴结转移和晚期（TNM期≥Ⅲ）疾病显著相关。HSP 90α表达水平高的患者的生存率明显低于HSP 90α表达水平低的患者。据此推测，HSP 90α过表达可能与胃癌患者的疾病进展和生存率有关[14]。

PPI结 果 显 示，ESR1与NCOA1、CALM2和NOS2等蛋白两两间存在较强的相互作用关系。NCOA1属于类固醇受体辅助活化因子家族成员之一，它在多种肿瘤的发生发展中起到关键作用[15]。ESR与F2、ADR家族成员和CHRM家族成员等在胃癌治疗中均有较强的中药作用。肾上腺素能受体（adrenergic receptor，ADR）、ESR的活化与胃癌的发生发展密切相关[15]。从信号通路分析，Ca2+主要参与细胞迁移，基因转录以及细胞死亡等[16]，Ca2+浓度的增加可以诱导癌细胞凋亡[17]。神经活性配体-受体信号通路是细胞膜上连接所有细胞内外信号通路相关的受体和配体的主要信号通路[18]。

在预后分析中发现ADRA1A、ADRA1B、AR、ESR1、F7、OPRD1、PTGS2、RXRA等因子的表达水平与胃癌患者的预后起到关键性作用。有研究证实ESR与肿瘤预后存在一定的关联[19]。在激素相关的癌症中，如乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌，ESRα表达主要通过调节PI3K/AKT信号通路促进疾病进展[20]。然而，高ESRα表达也与结直肠癌患者的不良生存结果显著相关[21]。因此，ESRα的调节是复杂的，它的作用是双向的。

综上所述，胃癌的发生发展是一个相对复杂的过程，它是一条由多基因、多因素和多信号通路交织的网络。本研究运用网络药理学和生物信息学分析夏天无治疗胃癌的潜在有效活性成分及对应的关键靶点，分析夏天无治疗胃癌的主要信号通路，为阐明其抗胃肿瘤的具体作用机制提供客观依据，也为今后进一步挖掘夏天无的临床功效提供理论支持，夏天无作为江西特有中草药，本研究为夏天无更好的服务于临床提供一定参考价值。但本研究并未考虑药物剂量、药物成分质量和给药方式对治疗结果的影响。因此，需要进一步的研究来验证本研究结果。