6种表面活性剂的生物毒性研究*

郑 璐

(中石化安全工程研究院有限公司，山东青岛 266104)

0 前言

表面活性剂是一类由疏水的非极性基团和亲水的极性基团组成，吸附于水油两界面，降低界面张力，提高界面活性的化学物质[1]。借助表面活性剂可提高石油开采过程中的采收率，按溶于水后的带电性质，可以将表面活性剂分为非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和两性表面活性剂。当前使用较多的有阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，阴离子表面活性剂包括磺酸盐类和羧酸盐类，非离子表面活性剂多为聚氧乙烯类[2]。表面活性剂可以和细菌生物蛋白质发生作用，加速蛋白质分子变性[3]，具有杀菌与消毒的作用，在工业行业中应用较为广泛。由于微生物生长变化可以直接反映出环境的受污染程度，因此将微生物作为表面活性剂毒性监测的指示者具有一定的实用价值。但目前针对表面活性剂生物毒性的研究较少，为识别表面活性剂的危害并对其安全使用提供参考，有必要进行表面活性剂的生物毒性研究。

生物毒性实验是利用敏感生物检测受试样品的毒性影响，评估表面活性剂对环境的毒性危害和潜在污染，是环境保护的有效手段之一。急性生物毒性实验可探明环境污染物与机体短时间接触后所引起的损害作用，可为环境污染提供预警[4,5]。发光细菌法是一种有效的急性毒性检测方法，快速、灵敏、简便且廉价，在有毒物质的筛选以及环境污染生物学评价等方面有重要应用。发光细菌在新陈代谢过程中能发出波长为490 nm左右的蓝绿色光(荧光)，体内ATP含量与发光强度呈正比。加入有毒物质后，处于活跃期的发光细菌会受到抑制甚至死亡，体内的ATP含量也会随之降低甚至消失，发光度将下降甚至到零[6]。1995年，我国国家环保局(即生态环境部)公布了关于发光细菌法监测水质毒性的国家标准《水质 急性毒性的测定 发光细菌法(GB/T 15441—1995)》[7]。但发光细菌法易受样品色度、浊度和盐度的干扰，而以大肠杆菌为测试菌时可规避这些问题，毒性分析结果更客观真实，且成本更低，检测范围更宽，适用于大批量的化合物和样品初筛[8]。基于基因工程技术，用含有发光基因(luxCDABE)的质粒构建重组发光工程菌，其反应原理与发光细菌类似。重组工程菌在毒性污染物检测、保存和运输过程等方面均非常稳定[9,10]。

生物毒性实验结果可用于进行污染物或化学品的生物安全评价。常用的方法有潜在毒性法、潜在生态毒性效应指数法和毒性单位分级评价法等。开展潜在毒性实验时，需将水样稀释2次，然后循环进行毒性实验，直到测试的水样无毒。该方法虽然简单方便，但只采用了一项生物毒性实验，缺乏代表性[11]。Costan，等[12]利用潜在毒性效应指数法评价水体毒性，但该方法需考虑水体排放量，不适合进行化学品的生态安全评价。Persoone，等[13]提出的毒性单位分级评价方法可根据生物毒性实验结果，基于毒性分级体系，进行污染物的安全性评价。该方法可综合利用多种生物毒性实验结果，适用于评价表面活性剂的生物毒性。

表面活性剂作为职业暴露人群在操作环境中经常接触的化学品，具有致突变性，故研究其在环境致突变中的作用十分必要。遗传物质DNA的改变会诱发突变，本文通过体外凝胶电泳实验研究表面活性剂对质粒DNA的损伤作用，进而评价和预测化学品对人体可能造成的危害。

本文以502发光菌、重组大肠杆菌和大肠杆菌为受试微生物开展急性毒性实验，由于502发光菌和重组大肠杆菌发光强度的减弱以及大肠杆菌存活数量的降低，均由表面活性剂的暴露所引起，存在明确的剂量效应关系。通过毒性单位分级评价方法对表面活性剂的一般急性毒性进行综合评价，并从特殊毒性研究了其对体外DNA分子的损伤效应，为表面活性剂的危害识别、安全使用及环境健康安全性指标提供支撑和参考。

1 材料与方法

1.1 试剂材料与仪器

超净工作台(ACB-4A1，ESCO，新加坡)；高压蒸汽灭菌器(SX-500，TOMY，日本)；生化培养箱(IFR250，GREIRM，德国)；电泳槽(北京六一生物科技有限公司，中国)；多功能酶标仪(Varioskan LUX，Thermo fisher，美国)。

1.2 供试生物

1.2.1 502发光菌

供试发光细菌为滨松光子502冻干粉，明亮发光杆菌(Photobacterium phospholem 502)，好养菌，安瓿瓶包装，每瓶0.5 g，置于120 r/min、20 ℃空气摇床复苏培养。

1.2.2 大肠杆菌

供试大肠杆菌为大肠埃希氏菌冻干粉(Escherichia coli)，CICC编号为10899，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，好氧菌，置于135 r/min、37 ℃空气摇床复苏培养。

1.2.3 重组大肠杆菌

稳定发光的重组大肠杆菌为稳转pGENluxCDABE低拷贝质粒的Escherichia coli DH5α，pGENluxCDABE质粒携带luxCDABE基因，购自Addgene，好养菌。

1.2.4 质粒

在体肠实验中，TPGS-CS/PTX胶束溶液和PTX聚氧乙烯氢化蓖麻油EL-40乙醇（1∶1）溶液相比，前者的载药量大，主药吸收更多。在结肠中Ka较大，而在十二指肠较小，与文献报道[17]不同。实验结果初步表明，TPGS-CS/PTX胶束能提高难溶性药物PTX的生物利用度。进一步的吸收机制研究如黏蛋白吸附、采用香豆素作为荧光探针标记的材料在Caco-2细胞中的摄取等实验也已完成，表明TPGS- CS能使摄取增加。其他机制研究正在进行中。

质粒pBR322 plasmid DNA购自New England Biolabs，货号为N3033S。

1.3 供试药剂

以某工厂注聚大队化学驱15号注聚站现役的6种表面活性剂为供试药剂进行毒性研究，化学驱重点实验室主要开展聚合物驱、三元复合驱、二元复合驱和非均相复合驱等驱油技术的研究，其中氟碳表面活性剂和磺酸盐表面活性剂的应用最为广泛。供试药剂相关信息见表1。

表1 6种待试药剂性质

1.4 实验方法

1.4.1 502发光菌急性毒性实验

参考GB/T 15441—1995开展样品对502发光细菌的急性毒性实验。实验前，复苏502发光细菌，传代备用。表面活性剂分别设置5个不同的浓度梯度，每个梯度3个平行，实验样品均使用灭菌的3% NaCl溶液进行梯度稀释。采用白色不透明的96孔微孔板，每孔加入99 μL待测样品和502发光菌溶液1 μL，迅速置于(25±2) ℃板式摇床混匀15 min，使用Thermo多功能酶标仪化学发光模块进行相对光单位测定。

1.4.2 大肠杆菌急性毒性实验

实验前，复苏大肠杆菌，传代备用。表面活性剂分别设置5个不同的浓度梯度，每个梯度3个平行，实验样品均使用灭菌的蒸馏水进行梯度稀释。采用透明96孔微孔板，每孔加入1 μL或10 μL待测样品以及相应的大肠杆菌溶液99 μL或90 μL，对照组相应加入1 μL或10 μL的蒸馏水，使其终体积为100 μL。实验孔四周用100 μL蒸馏水液封，封口膜沿96孔板四周缝隙密封，放置于37 ℃、135 r/min的摇床中培养24 h，随后于Thermo多功能酶标仪中检测，检测前振荡5 s，在600 nm处测得其吸光度。

1.4.3 重组大肠杆菌急性毒性实验

实验前，复苏重组大肠杆菌，传代备用。表面活性剂分别设置5个浓度梯度，每个梯度3个平行，实验样品均使用灭菌的0.5% NaCl溶液进行梯度稀释。采用白色不透明96孔微孔板，每孔加入99 μL待测样品和重组大肠杆菌溶液1 μL，迅速置于(25±2) ℃板式摇床混匀15 min，使用Thermo多功能酶标仪化学发光模块进行相对光单位测定。

1.4.4 DNA损伤实验

分别加入一定浓度的表面活性剂、过硫酸铵(ammonium persulfate，APS)和10 mg/μL pBR322 DNA于37 ℃孵育30 min，冰浴终止反应，加入溴酚兰上样缓冲液并立即电泳。采用水平凝胶电泳，先将1%琼脂糖100 ℃溶于1×TAE缓冲溶液，待温度降至约60 ℃时加入2.5 μL SYBR Green染料，上样，100 V电泳60 min，扫描电泳结果并采集图像。

1.5 毒性等级划分

采用急性毒性单位(TUa)表征表面活性剂的生物毒性，TUa=1/EC50，根据Persoone，等[13]提出的毒性分类系统，急性毒性效应分为5级，分别为：无毒TUa<0.4，微毒0.4≤TUa<1，有毒1≤TUa<10，高毒10≤TUa<100，剧毒TUa≥100。分别对每种菌、每种表面活性剂的TUa值单独计算，并计算每种表面活性剂关于3种菌TUa的几何平均数得到TUa(综)，用以表征每个表面活性剂的综合毒性[14]，TUa(综)的计算如式(1)所示。

(1)

1.6 统计分析

数据结果用平均值±标准误差表示，采用SPSS统计分析软件(PASW Statistics 18)进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)。“*”表示2组之间有显著差异(p<0.05)；“**”表示2组之间有极显著差异(p<0.01)。表面活性剂生物毒性的剂量—效应关系用非线性函数表示，选择SPSS软件中的Probit回归分析且以Logit函数进行非线性拟合。

2 结果

2.1 6种表面活性剂对502发光菌的急性毒性

GB/T 15441—1995选用氯化汞作为毒性参照物，但氯化汞为国家控制剧毒化学品，危害人体健康和生态环境，不易购买。因此，实验依据ISO 11348—3标准方法要求，选择了易溶、稳定、常见、价廉且对人体和环境危害小的ZnSO4·7H2O作为毒性参照物。阳性质控ZnSO4的EC50值为9.70 mg/L(图1)，基本符合美国标准方法的规定(ZnSO4的EC50值为5～12 mg/L)[14]。根据预实验结果，分别确定了6种表面活性剂EC50值的浓度范围；6种表面活性剂对502发光菌的活性抑制具有持续增强的剂量效应关系，502发光菌的相对发光率随6种表面活性剂浓度的增加而降低，表面活性剂的毒性大小与浓度呈正相关。图1结果表明，6种表面活性剂对502发光菌均具有抑制作用。其中，表面活性剂4和3对502发光菌的急性毒性最高，EC50值分别为0.6%和1.0%；其次为表面活性剂6、5和2，EC50值分别为1.1%、1.3%和2.4%；表面活性剂1对502发光菌的急性毒性最低，EC50值为31.4%。

图1 6种表面活性剂对502发光菌的毒性作用

2.2 6种表面活性剂对重组大肠杆菌的急性毒性

重组大肠杆菌急性毒性实验中，阳性参照物ZnSO4的EC50值为2.46 mg/L(图2)，低于502发光菌，表明重组大肠杆菌的灵敏度高于502发光菌。6种表面活性剂对重组大肠杆菌的发光强度具有不同程度的抑制作用，除表面活性剂1在低浓度组发光强度略有增加外，其余表面活性剂的发光强度均随暴露剂量的增加而降低。其中，表面活性剂3、4、6、2和5对重组大肠杆菌的急性毒性较高，EC50值分别为0.4%、0.4%、0.5%、0.6%和0.8%；表面活性剂1对重组大肠杆菌的急性毒性相对较低，EC50为6.3%，这与表面活性剂1对502发光菌具有相对较低的急性毒性结果是一致的，但6种表面活性剂对重组大肠杆菌的急性毒性远高于502发光菌。

图2 6种表面活性剂对重组大肠杆菌的毒性作用

2.3 6种表面活性剂对大肠杆菌的急性毒性

表面活性剂暴露于大肠杆菌24 h后，表面活性剂1～4表现出显著的急性毒性效应，对大肠杆菌的生长抑制随浓度的升高而增强。表面活性剂1～4的EC50值分别为6.5%、2.2%、7.1%和6.2%；而表面活性剂5和6并未观察到对大肠杆菌的急性毒性作用，如图3(因表面活性剂5和6的样品稀释浓度范围跨度较大，为能更直观的表现其毒性作用趋势，故横坐标取对数)。

图3 6种表面活性剂对大肠杆菌的毒性作用

2.4 综合毒性

对于502发光菌，表面活性剂1的毒性作用最低，毒性分级为有毒，EC50值为31.4%(表2)；表面活性剂4的毒性最高，为剧毒，EC50值为0.6%，是表面活性剂1的52.33倍，各表面活性剂对502发光菌的急性毒性由大到小依次为表面活性剂4>3>6>5>2>1。重组大肠杆菌与502发光菌的结果类似，表面活性剂1的毒性最低，为高毒，EC50值为6.3%；表面活性剂3和4的毒性最高，为剧毒，EC50值均约为0.4%，是表面活性剂1的12.6倍，各表面活性剂对重组大肠杆菌的急性毒性由大到小依次为表面活性剂4=3>6>2>5>1。对于大肠杆菌，表面活性剂1～4对其毒性均为高毒。通过计算3种菌对各表面活性剂EC50值的几何平均数进行综合毒性分级，发现6种表面活性剂均表现出了较高水平的综合急性毒性，其中表面活性剂1为有毒，表面活性剂2～6为高毒。各表面活性剂的综合急性毒性由高到低依次为表面活性剂4>3>2>6>5>1。

表2 6种表面活性剂对502发光菌、重组大肠杆菌和大肠杆菌的综合毒性

2.5 表面活性剂诱导体外DNA断裂损伤效应

质粒pBR322 DNA为超螺旋双链环状DNA，受到氧化等损伤时可引起DNA单链断裂，构型转变为开环形，进一步损伤则引起双链断裂变成线形，故电泳图(图4)pBR322 DNA条带可表现为超螺旋带(Supercoiled DNA，SC)、开环带(Open Circle DNA，OC)和线形带(Linear DNA，LI)，利用pBR322 DNA条带变化可直接指示DNA在外源化学品作用下的构型变化和损伤。

图4 6种表面活性剂对质粒DNA的损伤效应

在不同稀释浓度下，6种表面活性剂诱导质粒DNA损伤情况如图4。Lane 8、24、40、56、72和88为空白对照组质粒DNA，全部为SC，表明质粒在反应体系中基本保持完整。而添加表面活性剂后，在体外条件下均可直接对DNA产生不同程度的影响。高浓度表面活性剂1(0.5%～5%)或3(5%)与DNA共同孵育，DNA表现出明显拖尾，且条带不清晰；表面活性剂2(0～5%)的暴露表现出浓度依赖的轻微拖尾现象；表面活性剂5或6的高浓度处理组(0.037 5%～0.05%)表现出轻微拖尾和多个DNA条带，推测可能是OC或LI DNA，且表面活性剂5和6的最小有作用剂量相对较低；表面活性剂4的较高浓度组(2.5%～5%)表现出轻微的DNA条带模糊。初步推测6种表面活性剂可能与DNA有直接的相互作用，导致DNA在电场内出现不同程度的涌动受阻变慢现象。自由基氧化剂APS与质粒DNA共同孵育时，APS能够产生自由基攻击DNA，导致大量单链和双链断裂DNA产生，使双螺旋结构断裂成开环和线性，表现为SC减少，OC增加，且有部分LI出现。

在表面活性剂与DNA的反应体系中加入APS，观察表面活性剂是否能增强或减弱APS诱导的氧化损伤，分析表面活性剂对DNA的损伤作用机理。结果显示，表面活性剂1～4的低浓度组、表面活性剂5和6的中浓度组均能够降低APS诱导的DNA损伤作用，表现出SC增加，LI的消失及OC的降低，可能在中低浓度表面活性剂的存在下，APS产生的自由基首先攻击结合在DNA上的表面活性剂，从而表现出表面活性剂的保护作用；但当表面活性剂浓度较高时，大量表面活性剂直接与DNA作用导致DNA损伤和拖尾。表面活性剂引起的DNA损伤，可能是因其与DNA结合导致的，仍需进一步研究探索。

3 讨论

本研究在某工厂共采集表面活性剂6种，以同一营养级3种微生物(即502发光菌、重组大肠杆菌和大肠杆菌)为受试微生物，开展6种表面活性剂的急性毒性实验。结果发现，6种表面活性剂对502发光菌和重组大肠杆菌均有毒性作用，虽然2种菌对6种表面活性剂的敏感性不同，但毒性效应趋势类似，即表面活性剂3和4的毒性作用最高，表面活性剂1的毒性作用最低，表明表面活性剂对这两种发光菌的光强抑制作用具有一致性，同时，表面活性剂1～4对大肠杆菌的存活率也具有较强的抑制作用。

对3种微生物的综合毒性计算结果显示，1种表面活性剂的毒性分级为有毒，5种为高毒。基于配方保密的需要，仅获知表面活性剂1～4的类型为氟碳表面活性剂，表面活性剂5和6属于磺酸盐型表面活性剂，由于6种表面活性剂的具体成分信息与各组分之间的配比无法获得，故未能对表面活性剂组分与其急性毒性进行相关性分析。Bento，等[15]发现油田采出水对海洋发光细菌费氏弧菌具有中等毒性，其中，表面活性剂是急性毒性的主要来源，这与文中6种表面活性剂的生物急性毒性评价结果中的毒性较高类似。可能是因为表面活性剂与生物细胞膜之间的电子效应可增加两者之间的接触比例，增加膜的通透性造成细胞死亡[16,17]。

本研究发现不同微生物对表面活性剂的敏感性不同。在3种受试微生物中，6种表面活性剂的重组大肠杆菌毒性测试结果均低于502发光菌和大肠杆菌，表明重组大肠杆菌对表面活性剂体系较敏感。前期研究发现，重组大肠杆菌与502发光菌相似，整个生长期均有发光，虽然发光强度较502发光菌低，但在生长早期即可进入发光稳定期，表明其更适合作为毒性分析的指示生物。相较于502发光菌，重组大肠杆菌能较灵敏的检测到大部分环境水样的生态毒性，本研究也发现重组大肠杆菌的毒性检出灵敏度较高，推测重组大肠杆菌可能更适合作为生态监测或生物毒性的测试用菌。

对于表面活性剂，仅从急性毒性实验结果评价其对环境的影响，不能全面正确地反映其毒性，越来越多的研究者致力于研究污染物的毒性作用本质，试图从分子水平阐明毒物的致毒机理，DNA作为遗传信息载体，通过其正常的转录翻译和稳定的复制，保持生命的正常活动及种族特性，DNA被外源化合物攻击后易造成链断裂和碱基错配等损伤，可导致癌症等多种遗传疾病的产生[18]。本研究通过琼脂糖凝胶电泳分析DNA分子构型变化，研究表面活性剂对体外DNA分子的损伤效应，发现6种表面活性剂可诱导DNA损伤和拖尾，推测表面活性剂可直接与DNA结合引起DNA损伤，且相较于表面活性剂1～4，2种磺酸盐类表面活性剂5和6可诱导产生更严重的DNA损伤。已有文献发现，磺酸盐类以高效的界面活性、原料易得和成本较低等优势已成为表面活性剂体系中的“佼佼”者[19]，但根据本研究发现，其可能具有遗传毒性，这可能会对职业暴露人员的健康造成不利影响。

4 结论

通过Persoone毒性作用分级综合评价，发现6种表面活性剂均表现出较高的急性毒性，重组大肠杆菌较502发光菌和大肠杆菌更敏感，更适合作为表面活性剂生物毒性的检测菌种。且发现表面活性剂可直接与DNA结合，继而诱导损伤，其中磺酸盐型表面活性剂毒性更强。本研究可帮助工厂管理者及作业人员正确认识表面活性剂的生物毒性及健康危害，为化学品的安全性评价、规范贮存、使用和处置提供科学依据。