毛叶木姜子嫩果香气成分不同萃取方法的比较

刘双双，梁淼，谢雅婷，冯亮，杨艳，余爱农*

(1.湖北民族大学 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000；2.湖北民族大学 化学与环境工程学院，湖北 恩施 445000)

毛叶木姜子(LitseamollisHemsl.)又称山胡椒、木姜子、大木姜，为樟科(Lauraceae)木姜子属，在我国主要分布于广东、湖北、四川等地，是我国特有的香料植物资源之一[1]。在中国西南部，毛叶木姜子的嫩果可以用酱油、醋、胡椒、大蒜和姜腌制成开胃凉菜或者提取其挥发油作为食物的调味料[2]，也可以作为天然杀菌料复合于食品调味料中，达到杀菌防腐、协调风味的多重效果，具有抗菌、镇咳、祛痰作用[3]。

作为一种香辛料，其香气对于产品加工至关重要。毛叶木姜子嫩果所呈现的香气会显著影响消费者对其的接受程度，提取方法的不同会导致不同香气成分的呈现与分布。目前，香气成分的主要萃取方法有水蒸气蒸馏法、溶剂辅助风味蒸发法和顶空固相微萃取法。陈汉平等[4]首次采用精密分馏结合硅胶柱层析和气相层析从成熟毛叶木姜子果实精油中分离出21种挥发性成分；瞿万云等[5]采用正交实验法探究了超临界CO2萃取毛叶木姜子果实挥发油的最佳提取条件；林翠梧等[6]、Huang等[7]通过水蒸气蒸馏法从毛叶木姜子叶和枝的挥发油中分别鉴定出41种和39种挥发性成分。但是，作为我国西南地区普遍食用的开胃凉菜——毛叶木姜子嫩果的香气成分的研究还未见报道。

本文采用SDE和HS-SPME两种方法提取毛叶木姜子嫩果中的挥发性物质，采用气相色谱-质谱联用法对香气风味物质进行检测，比较两种萃取方法所提取的毛叶木姜子嫩果香气成分的差异和萃取特点，为进一步研究毛叶木姜子特征风味组分提供了理论依据，同时研究毛叶木姜子中风味化合物的组成，加快毛叶木姜子相关产品的工业化进程。

1 实验部分

1.1 材料与试剂

毛叶木姜子嫩果于2019年5月采集于湖北恩施龙洞河(海拔550 m)，经湖北民族大学林学园艺学院易咏梅教授鉴定为樟科毛叶木姜子。

氯化钠、二氯甲烷：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；1-辛醇(≥98%)：美国Supelco公司、C7～C30 正构烷烃：美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器和设备

JYZ-E16 榨汁机、高速破壁调理机 九阳股份有限公司；同时蒸馏萃取装置 上海方畦仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；Avanti J-30Ⅰ冷冻高速离心机 美国贝克曼库尔特有限公司；6890N/5975MSD气相色谱-质谱联用仪 美国安捷伦公司；固相微萃取头(50/30 μm DVB/CAR/PDMS) 美国Supelco公司；SHZ-Ⅲ循环水式多用真空泵 临海市谭氏真空设备有限公司；Concept多功能样品前处理系统 德国PAS 公司；数显磁力搅拌恒温电热套 天津赛得利斯实验分析仪器制造厂。

1.3 实验方法

1.3.1 同时蒸馏萃取

取50.0 g样品加入200 mL蒸馏水于破壁机中破壁5 min后置于500 mL圆底磨口烧瓶中，并加入磁力搅拌子，置于装置样品端；另取一支干净的250 mL圆底磨口烧瓶，加入60 mL二氯甲烷，接于装置溶剂端。将装置通入冷凝水(4 ℃)，加热蒸馏萃取，样品端控制样品处于微沸状态；溶剂端设定温度为50 ℃，蒸馏萃取3 h，冷却，取二氯甲烷萃取液，旋转蒸发浓缩去二氯甲烷，得到萃取物约1.0 mL。

1.3.2 顶空固相微萃取

取100.0 g毛叶木姜子果实样品解冻至室温后立即榨汁过筛(200目)后取10.0 mL于萃取瓶中，加入2.0 g NaCl和磁力搅拌子，于50 ℃下平衡30 min，萃取36 min，解吸2 min。

1.3.3 GC-MS 分析

采用DB-5MS毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；进样口温度 250 ℃；起始柱温 40 ℃，保持 4 min；以 5 ℃/min 升温至 260 ℃；以 15 ℃/min 升温至 280 ℃，保持 1 min；载气(He)流速 1 mL/min；HS-SPME不分流进样，SDE分流进样，分流比 50∶1。MS：离子源温度 250 ℃；电子轰击(EI)模式；电子能量 70 eV；质量扫描范围 40～550 u；扫描方式为全扫描；调谐文件为标准调谐。

1.3.4 定性定量分析

1.3.4.1 定性分析

用3种方法对毛叶木姜子嫩果香气成分进行定性分析，首先，根据 NIST 08 数据库对谱图进行初步检索及质谱分析；其次，根据测定的保留指数(RI)，与文献报道的保留指数进行比对辅助定性；最后，用标准物质辅助定性。保留指数以 C7～C30 正构烷烃混合物单独进样，其前处理及 GC-MS 分析方法与样品处理一致。

1.3.4.2 定量分析

对毛叶木姜子挥发性成分分离鉴定时采用内标法进行定量，内标物为1-辛醇标准品的乙醇溶液(1.570 7 g/L)。根据1-辛醇的质量浓度和各样品中1-辛醇峰面积的比值进行比较。根据公式(1)计算出挥发性成分的量，每个样品重复3次实验，取平均值。

(1)

式中：xi为组分含量，μg/L；ms为内标化合物质量浓度，μg/L；Ai为化合物的峰面积；As为内标物峰面积；fi为待测组分(i)对内标物(s)的质量校正因子，令其为1。

1.3.5 香气活度值(OAV)的计算

根据毛叶木姜子香气成分的含量，以及各化合物在水中的气味阈值来计算OAV值。

(2)

式中：ρ为该化合物的质量浓度，μg/L；OT为该化合物在水中的气味阈值，μg/L。

2 结果与分析

2.1 毛叶木姜子中挥发性风味物质GC-MS分析结果

采用GC-MS法检测毛叶木姜子嫩果样品中的挥发性风味成分，采用HS-SPME法和SDE法提取毛叶木姜子中挥发性风味物质的GC-MS总离子流色谱图，见图1；经MS/RI定量，香气成分及其含量见表1。

图1 SDE及HS-SPME法提取毛叶木姜子嫩果中挥发性风味物质的GC-MS总离子流色谱图Fig.1 GC-MS total ion current chromatograms of volatile flavor substances extracted from ILMF by SDE and HS-SPME

由图1可知，SDE法与HS-SPME法提取的毛叶木姜子嫩果挥发性成分有一定的差异，两种提取方法均可提取到含量较高的α-柠檬醛、β-柠檬醛，但保留时间在10～15 min之间含量最高的化合物分别为枞油烯和桉叶醇。HS-SPME在保留时间10～20 min之间提取到的化合物数量较多且含量高，由表1可知多为单萜类化合物；而SDE法的提取物中检测到的分子量比较大的化合物在HS-SPME提取法中未检测到。

表1 SDE与HS-SPME法提取毛叶木姜子嫩果中的香气化合物Table 1 Aroma compounds extracted from ILMF by SDE and HS-SPME

续 表

续 表

续 表

续 表

结合表1中数据，发现经过 GC-MS 分析，SDE法和HS-SPME法提取共检出毛叶木姜子键合态挥发性成分88种，包括醇类3种，萜烯类40种，含氧萜类32种，酯类4种和其他类9种，其中SDE法检测到50种挥发性化合物，HS-SPME法检测到71种化合物，两种提取方法共同检测到的化合物有33种。

表2 SDE法与HS-SPME法提取毛叶木姜子嫩果中香气化合物的种类和浓度占比Table 2 Types and concentration percentages of aroma compounds extracted from ILMF by SDE and HS-SPME

由表1和表2可知，经SDE提取法提取，产物经GC-MS检测，共检测到醇类1种、萜烯类22种、含氧萜类16种、酯类3种和其他类8种，其中含氧萜类(65.79%)和萜烯类(28.24%)含量较高。含量较高的化合物主要包括枞油烯、石竹烯、芳樟醇、β-柠檬醛、α-柠檬醛、4-羟基龙脑烷等；用HS-SPME法提取时，共检测到醇类2种、萜烯类35种、含氧萜类28种、酯类3种和其他类3种，此种方法提取到的化合物数量较多，但浓度较高的只有含氧萜类化合物，由萜醇、萜醛、萜酯等组成，占总化合物浓度的93.72%，为毛叶木姜子嫩果提供了许多独特的风味。其中，含量较高的化合物有桉叶醇、橙花醇、β-柠檬醛、香叶醇、α-柠檬醛等。萜类化合物通过特定植物组织中的类异戊二烯途径分泌，是影响水果特性的最重要的芳香化合物[8]。

SDE提取法萜烯类化合物虽然种类较少，但是含量高于HS-SPME提取法的化合物浓度，尤其是枞油烯、α-蒎烯、β-蒎烯。枞油烯多存在于野花椒等香料的精油中，α-蒎烯、β-蒎烯是天然存在的双环单萜烯的最重要骨架。SDE法提取的温度较高，而含氧萜类化合物在高温下易脱水、重排形成萜烯类化合物，因此存在于大多数樟科属植物中的桉叶醇只在提取条件较温和的HS-SPME法提取中检出。HS-SPME提取法对大多数含氧萜类提取效果较好，尤其是萜醇类化合物；而SDE提取法对一些高沸点和分子量较大的挥发性物质提取更有优势，如亚油酸、亚麻酸、棕榈酸乙酯、9,12-十八酸乙酯等，这类化合物在HS-SPME中下提取均未检测到。

毛叶木姜子嫩果香气成分浓度对比见图2。结果显示：SDE提取法的萜烯类和酯类化合物虽数量少但其浓度均高于HS-SPME提取法的化合物浓度；HS-SPME提取法含氧萜类数量及浓度均高于SDE提取法，主要包括萜醇、萜醛和萜酯等。采用HS-SPME法提取的醇类、萜类、酯类物质种类较多，而SDE法对中低沸点物质的提取更有优势，这可能是由于SDE的高温长时间处理造成部分热敏性挥发性物质被氧化、分解[9]。

图2 SDE法与HS-SPME法提取毛叶木姜子嫩果香气成分浓度对比Fig.2 Comparison of concentrations of aroma components extracted from ILMF by SDE and HS-SPME

2.2 不同提取方法香气成分香气活度分析

为了评估各种挥发性化合物对毛叶木姜子嫩果果实的香气贡献，用化合物浓度的平均值和水中的气味阈值来计算OAV值。当OAV值大于1.0时，挥发性组分才被认为对香气有贡献。两种萃取方法香气描述及分类见表3。

表3 SDE与HS-SPME提取的挥发性成分香气特征及香气活度值Table 3 Aroma characteristics and odor activity values of volatile components extracted by SDE and HS-SPME

续 表

由表3可知，两种提取方法共检出88种游离态挥发性化合物，其中36种具有明确香气特征，包括1种醇类，10种萜烯类、18种含氧萜类、2种酯类和5种其他类化合物。在SDE提取法下，有24种组分的OAV>1，其中对毛叶木姜子嫩果香气贡献较大的有α-蒎烯、β-水芹烯、β-蒎烯、石竹烯、芳樟醇、香茅醛、(R)-香茅醛、β-柠檬醛、香叶醇、α-柠檬醛、甲基庚酮、亚麻酸等；在HS-SPME提取法下，也有24种组分的OAV>1，其中对毛叶木姜子嫩果香气贡献较大的有α-蒎烯、α-水芹烯、对甲苯、桉叶醇、芳樟醇、香茅醛、β-柠檬醛、香叶醇、α-柠檬醛和甲基庚酮等。由此可见萜类化合物对毛叶木姜子香气起到了主要贡献作用。两种提取方法下α-柠檬醛和β-柠檬醛香气活度值最高，赋予毛叶木姜子嫩果柑橘、柠檬香气，由于HS-SPME提取法下这两种化合物浓度均远高于SDE法，因此其果香香气更显著；其次是芳樟醇，它是一种重要的水果和花卉萜醇类化合物，通常通过水解、氧化还原反应和重排产生，由于其香气阈值较低，因此对毛叶木姜子嫩果香气贡献较大，使毛叶木姜子嫩果呈现铃兰、柑橘和葡萄的香气[11]；香叶醇赋予其花香和果香。甲基庚酮是番茄红素、α-金合欢烯、柠檬醛或共轭三醇的氧化副产物或降解产物，呈现果香和青草味[12]。SDE提取法下的α-蒎烯香气活度值较高，使毛叶木姜子嫩果呈现樟脑味、松树味[13]，石竹烯主要存在于胡椒和一些香料中，呈现甜香和木香[14]，由于SDE提取法下的石竹烯含量较高，因此SDE法提取下的毛叶木姜子嫩果的甜香和木香特征比HS-SPME提取法下的更显著；HS-SPME提取法在毛叶木姜子中检测到的桉叶醇使其具有桉树的气味[15]；而对甲苯则使毛叶木姜子具有辛辣、霉味等令人不愉快的气味[16]。

化合物的气味描述取决于气味浓度，通常也用不同的特征方向来描述气味，见图 3。

图3 两种提取方法下香气特征雷达图Fig.3 Aroma characteristic radar diagram under two extraction methods

将化合物分为甜香、花香、木香、果香、草本香和化学味，得到两种提取方法下毛叶木姜子芳香化合物的香气特征。由图3可知，SDE提取法下的木香、甜香、化学味更显著，主要来自于α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯的贡献，化学味主要来自亚麻酸产生的脂肪味[17]；HS-SPME提取法下果香和花香更显著，主要来自芳樟醇、香茅醛、α-柠檬醛、香叶醇、β-柠檬醛的贡献。相比之下，HS-SPME提取的香气化合物更贴近毛叶木姜子的原始风味。

3 结论

采用两种不同的样品前处理方法对毛叶木姜子嫩果中游离态挥发性化合物进行了提取，并结合GC-MS分析技术经RI/MS定性共得到88种香气成分。其中SDE法和HS-SPME法分别检测到50种和71种化合物，两种提取方法共同检测到的化合物有33种，含量较高的化合物主要有α-柠檬醛、β-柠檬醛、α-蒎烯、β-蒎烯、香叶醇等。SDE法和HS-SPME法提取的香气成分均以含氧萜类为主，分别占总浓度的65.79%和93.72%。

两种方法所提取的挥发性风味物质有一定差异，共36种化合物具有明确香气特征。SDE提取法下对香气贡献较大的化合物有α-蒎烯、β-蒎烯、石竹烯，因此其木香、甜香以及化学味较显著；而HS-SPME提取法下的果香和花香更显著，对香气贡献较大的化合物有芳樟醇、香茅醛、α-柠檬醛、香叶醇以及β-柠檬醛等。

SDE法提取温度较高，对分子量较大的化合物提取效果较好，但一些重要的萜类化合物容易转化分解，造成香气损失，而HS-SPME法提取条件温和，萜类物质不易发生转化，接近毛叶木姜子的原始风味，因此较适用于毛叶木姜子嫩果香气成分的分析研究。