不同产地与品种大豆籽粒的感官与挥发性风味物质差异鉴别

史金枫，李敏敏，黄亚涛，孙玉凤，王凤忠*，张景俭

(1.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193；2.沧州市农林科学院，河北 沧州 061001)

大豆是补充多种营养成分的粮食作物，同时也是多种特色风味农产品的加工原料[1-2]，包括具有醇香味道的豆奶、豆浆，以及利用大豆酿造或发酵生产的酱料、豆乳等调味制品[3-4]。目前我国自产及进口大豆产区分布较广、品种繁多，而不同产地的气候、栽培及采收条件的不同会对大豆中所富含的挥发性香气成分含量造成影响，导致不同品种大豆在加工后拥有不同的感官品质和味觉水平[5-6]，如因品种的差异造成对原料筛选不当，则会造成加工产品的品质欠佳、味道不正，严重情况下会释放大豆的豆腥味，影响制品的风味水平及货架期[7-8]。

大豆及加工产品中的不良风味主要包括原料的豆腥味、豆油产生的哈喇味及酸败味等，这些不良风味与大豆中所富含的醛类、醇类及酸类等风味物质的释放密切相关[9-10]。目前针对不同品种大豆籽粒原料中的风味物质及其本身感官水平的差异研究较少，导致在大豆风味制品加工中所选择的依据较少。目前较为常用的固相微萃取-气相色谱-串联高分辨质谱技术(SPME-GC-QE)可以很好地对样品中的挥发性风味物质进行鉴别[11-12]，相较于传统的质谱技术，高分辨质谱的抗基质干扰及定性定量能力更强；而包括电子鼻与电子舌在内的电子感官技术可以对不同样品的气味及味觉活度水平作差异性分析[13-14]。

本研究选择国内外5个不同产区的70种大豆籽粒为研究对象，利用SPME-GC-QE、电子鼻与电子舌等检测方法分析不同大豆间风味物质的差异，探寻风味物质对大豆感官品质的影响，以期为大豆制品加工时原料品种和产地的选取提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

实验样品大豆：共有来自北方区域、东北区域、南方区域、国外地区和中黄大类品种共5个产地区域的大豆品种70个，由各省市大豆产业体系实验站提供，于中国农业科学院农产品加工研究所汇总贮藏。详细分组及产地信息见表1。

表1 大豆产地与编号信息Table 1 The places of origin and numbering information of soybeans

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1.2 主要仪器与设备

固体样品粉碎机 永康市铂欧五金制品公司；涡旋振荡器 美国Scientific Industries公司；电子天平 德国Sartorius科学仪器有限公司；KQ-600DE型超声机 昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q Advantage A10型超纯水机 美国Millipore公司；3K15型离心机 美国Sigma公司；Heracles Ⅱ型快速气相电子鼻、Asrree Ⅱ型电子舌 法国Alphamos公司；SPME固相微萃取装置(含50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头)；Trace 1310 Q Exactive GC型气相色谱-串联高分辨率质谱分析仪 美国ThermoFisher公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆样品的制备

将大豆籽粒分别利用固体粉碎机研磨成大豆粉末约20 g备用，过60目筛并密封于-20 ℃保存备用。

1.3.2 SPME-GC-QE分析

称取2.00 g大豆粉于螺纹顶空进样瓶中，首先对萃取头进行老化，以确保其表面残留物质可被完全去除，将老化好的萃取头插入螺纹顶空瓶中，通过进样器手柄推出萃取纤维头，使其暴露在顶空瓶顶空气体中，纤维头与样品不得有任何接触。用进样器将石英纤维头推回针头内并拔出，然后插入GC-QE进样器中，同时启动仪器收集数据。实验结果使用NIST 11.0数据库对未知挥发性化合物谱图进行比对，并采用峰面积归一化法进行定量。

1.3.3 固相微萃取条件

样品在55 ℃恒温下孵化并萃取1 h，随后升温至250 ℃解吸附3 min，最后在270 ℃下老化20 min。

1.3.4 色谱-质谱条件

色谱条件：使用VF-Wax型号色谱柱(60 m×0.25 mm，0.25 μm)，进样口温度保持在250 ℃，流速1 mL/min，分流比5∶1；初始温度40 ℃，保持2 min，随后以4 ℃/min的速度升温至230 ℃，保持5 min。

质谱条件：质谱扫描方式为EI全扫描模式，扫描质荷比范围30～400 m/z，传输线温度250 ℃，离子源温度280 ℃，电离能量70 eV。

1.3.5 电子鼻分析

称取大豆粉样品各1.00 g于顶空样品瓶中，在(25±1)℃实验室条件下静置10 min，确保样品中的挥发性气体充满顶空空间，每个样品重复3组平行。电子鼻开机后进两针空气样品，待仪器稳定后开始检测。检测过程中清洗传感器时间180 s，检测时间60 s。所测得的数据采用主成分分析法(principal component analysis, PCA)进行系统性分析。

1.3.6 电子舌检测

准确称取大豆粉样品5.00 g置于离心管中，加超纯水稀释至150 mL，涡旋振荡后密封进行超声处理5 min，使样品与水混合均匀；以10 000 r/min的转速离心10 min，取出离心管后用针头吸取清液上层漂浮油脂，以0.45 μm水相滤膜对中间层清液进行抽滤，每种样品得到至少100 mL澄清水溶液以上机测定。电子舌开机后活化味觉传感器，建立样品分析表；样品烧杯与洗涤超纯水烧杯按顺序间隔摆放在仪器托盘上，在托盘上放置完样品后开始进行味觉传感器扫描检测，每采样一次，传感器自动进入超纯水清洗一次。为避免初始检测响应信号不稳定，每个样品重复扫描次数为7，在获得分析数据后为避免误差，摒除前3圈数据，只采用后4圈稳定的电子舌响应数据。

2 结果与分析

2.1 电子感官分析结果

大豆中所含有的风味化合物含量水平会对感官造成直接影响。在针对不同加工制品筛选大豆原料的过程中，需要对大豆籽粒的感官进行鉴别，筛选适宜不同产品的大豆原料。本研究利用电子感官技术对不同产区与品种大豆的气味、味觉活度水平进行比较分类，探寻大豆感官品质的差异。电子鼻PCA分析结果见图1。

图1 不同产地区域大豆品种分类图Fig.1 Classification diagrams of soybean varieties from different places of origin

由图1可知，在北方地区，大多数品种呈现聚集趋势，气味水平差异较小，CD4、CD5与SD11的组内平行样本间差异虽较小，但与其他品种呈现明显分离趋势；而5X品种的平行样本间分离趋势较大，且同样与其他品种分离趋势显著。东北与国外地区的大豆整体聚集趋势明显，但东北地区的JLDLW与其他大豆差异明显，JLDLW是拥有多个杂交母系的混育大豆品种，推测其与其他品种的差异与此有关；国外地区的BX大豆的一项平行样本数据显示与其他大豆数据点位分离趋势明显，推测可能是由于仪器或样品本身带来的实验误差。而中黄与南方地区的大豆品种呈现较为明显的分离趋势，表明两地的大豆品类间存在较为明显的气味差异。南方大豆中广西地区的GC与GX品种呈聚集趋势，其余品种离散趋势明显。

2.2 大豆中的风味化合物分析结果

2.2.1 大豆风味化合物分析

大豆样品经GC-QE测定后，结果通过NIST 11.0谱库筛选匹配度大于80%的化合物即为所鉴别出的风味化合物[15]，共有63种，其中包括烷烃类物质13种、醛类物质3种、醇类物质9种、苯类物质7种、烯类物质6种、酯类物质2种、酮类物质9种以及醚类和呋喃类等其他物质14种。各物质保留时间及相对含量见表2。

表2 不同区域大豆中挥发性风味物质及其含量Table 2 The volatile flavor compounds and their content in soybeans from different regions

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由表2可知，除北方地区与国外区域外，其他3个地区大豆中含量最高的物质均为3-己基戊基-3,4-二烯(东北23.74%，南方20.34%，中黄16.95%，出峰时间6.27 min，见图2)，3-己基戊基-3,4-二烯在大豆或其他类别农产品风味化合物的相关研究和记载中极少出现，目前尚未知其在大豆中的合成来源与风味贡献；北方地区含量最高的物质为正己烷(含量12.24%，出峰时间4.82 min)，国外地区含量最高的物质为甲苯(含量13.19%，出峰时间11.83 min)。其他在5个地区大豆中具有较高含量且响应值较高的物质还包括戊烷、乙酸乙酯、2-丁酮、甲苯、正己醛、1,3-二甲基苯、柠檬烯、正己醇、3-辛醇和乙酸，平均含量范围在2%～10%。在大豆中这12种物质含量的总和分别占5个产地区域的67.18%、69.72%、64.47%、53.97%和59.24%，初步推测其是大豆中具有较高贡献值的挥发性风味化合物。

图2 不同地区大豆挥发性成分的总离子流色谱图Fig.2 Total ion current chromatograms of volatile components in soybeans from different regions

其余经由GC-QE鉴别出的挥发性风味化合物含量多在0.5%以下且响应值较低，推测对大豆籽粒整体风味的影响不大，但在过往研究中，1-辛烯-3-醇和呋喃类物质被认为与大豆分离蛋白的脂肪氧化酶缺失具有一定关联，其同样对豆腥味的产生具有一定影响。由图2可知，1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃等物质在其保留时间点上响应值过低，含量不足1%，在大豆籽粒中此两类物质对整体风味的影响较小。

2.2.2 大豆风味化合物贡献率分析

为进一步探讨风味化合物对大豆籽粒整体风味的贡献率，采用ROAV法，针对含量较高的12类物质嗅觉阈值计算得出的ROAV判定其对大豆整体风味的贡献作用。嗅觉阈值通常指能够引起人体嗅觉产生最小刺激或反应的物质浓度。ROAV在挥发性风味化合物分析中可评价香气物质对原料风味的贡献，此处定义对于大豆整体风味贡献最大组分ROAVstan为100，其他挥发性化合物的ROAV按下式计算：

式中：Ti、Ci分别为各组分相应的嗅觉阈值(μg/L)和相对含量(%)；Tri、Cri分别为对样品整体风味作出贡献最大组分相对应的嗅觉阈值(μg/L)和相对含量(%)。一般认为，0.1≤ROAV≤1的物质对整体风味起修饰作用；ROAV>1的物质对整体风味起关键性作用。

表3 不同产地大豆中主要风味物质的ROAVTable 3 ROAVs of main flavor substances in soybeans from different places of origins

由表3可知，在这12种挥发性风味化合物中，有7种物质在5个产地区域大豆中的ROAV均小于0.1，包括戊烷、正己烷、3-己基戊基-3,4-二烯、乙酸乙酯、2-丁酮、甲苯和柠檬烯，说明这7类物质对大豆整体风味的贡献可忽略不计，虽然其在大豆中含量与响应值普遍较高，但由于其嗅觉阈值也普遍偏高(437～1 500 μg/L)，导致这些物质需在更高含量水平下才可被人体感知，故对大豆籽粒整体风味的贡献作用极小，但在加工过程中还需重点关注柠檬烯、乙酸乙酯等物质的含量积累是否会对加工品的香气产生良性影响。除国外地区(ROAV=0.61)外，其他4个产地区域的大豆中的正己醛ROAV均大于1(1.32～5.11)，正己醛在北方、南方和中黄大豆的ROAV均为12种物质中最高，表明正己醛普遍对国内大豆的风味起到关键作用；1,3-二甲基苯对中黄地区大豆的风味贡献极小，对其余地区的大豆风味起修饰作用；正己醇对国内大豆的ROAV在0.34～0.44之间，贡献作用偏低，仅对国内大豆风味起修饰作用，但对国外大豆风味的贡献作用较为显著(ROAV=1.06)，这也是由于国外地区大豆中的正己醇含量明显高于国内地区大豆。3-辛醇在5个产地区域中平均含量为4%～8%，嗅觉阈值在12种风味物质中最低(2.7 μg/L)，而其在5个产地区域大豆中，ROAV均大于1，且在东北地区大豆中所含风味物质ROAV达到2.33，表明3-辛醇对东北地区大豆风味作用较为显著。值得注意的是，这种物质在大豆类加工产品的风味中发挥的作用未见报道，但其在蘑菇、干酪等食品中被普遍用作增香类成分[16]，对于3-辛醇是否与大豆发酵或压榨过程中产生的香气物质有关，还需进一步的探索；乙酸在南方地区及中黄大豆ROAV分别为1.06和1.81，对这两个产地区域风味的贡献率较高，但对其余3个产地区域大豆风味的贡献作用较小，仅起到修饰作用。

经对比得出的对风味具有贡献作用的化合物在不同区域含量对比见图3。

图3 不同区域大豆中贡献率较高的风味化合物含量比较Fig.3 Comparison of content of flavor compounds with higher contributionrates in soybeans from different regions

北方地区的大豆的正己醛含量为5个产地区域中最高(见图3 中A)，而国外进口大豆中的正己醇含量显著高于其他地区3倍(见图3中 B)，正己醛和正己醇已被证明是豆腥味的主要来源，在大豆发酵制品及豆奶等产品的制作中被作为重点关注的风味化合物，微量的正己醛便会使人产生不良情绪[17]，说明北方与国外地区的大豆品种可能更易在加工中产生豆腥味，相较于其他品种,不适于发酵制品或其他风味产品的制作；东北地区大豆的正己醇含量、乙酸含量均显著低于其他4个产地，中黄大豆的乙酸含量在5个产地区域中最高(见图3中E)，且乙酸对中黄大豆的贡献率最大(ROAV=1.81)。正己醇是发酵过程中异味的主要来源，其不但会影响发酵制品的味觉水平，会对产品货架期等造成影响[18]；乙酸是大豆原料主要的酸败味来源，过多的乙酸含量会导致豆油的过氧化值水平提高，产生哈喇味,从而降低其感官水平[19]。因此表明中黄大豆相比于其他产地大豆，更不适于豆油类副食品的加工；东北地区大豆的风味化合物综合水平较高，且东北大豆在我国产量较大，是适宜用作风味制品加工、豆油加工等不同加工产业的优良品类。

2.2.3 电子舌分析结果

为探究大豆风味物质与其味觉活度水平的关系，采用电子舌对大豆滋味水平进行分析。通过电子舌味觉传感器分析后，在所有大豆原料中均鉴别出了咸味、鲜味和酸味。电子舌通过仪器的滋味传感器可以判明样品本身所带有的滋味及其响应值，从而判断样品在味觉水平上的差异。大豆原料本身虽然不可直接食用，但其中所包含的味觉活度会直接影响初加工及精深加工农产品的食用品质和味觉阈值[20]。

为判明5个产地区域内不同省份大豆品种间的味觉活度差异，基于方差分析法(ANOVA)对大豆中3种味觉活度水平进行单因素检验，结果见表4。

表4 基于ANOVA分析不同产地不同滋味类型的差异显著性Table 4 The significance of differences among different taste types in different places of origin based on ANOVA

由表4可知，北方区域大豆的酸度和咸度水平差异性较不显著(P>0.01)，鲜度水平差异较显著(P<0.01)；东北区域大豆的酸度与鲜度水平差异极显著(P<0.001)，咸度水平差异较显著(P<0.01);南方区域大豆除鲜度水平差异极显著(P<0.001)外，酸度与咸度水平差异均不显著(P>0.1)；国外地区与中黄品种大豆的3种味觉活度差异均极显著(P<0.001)。综上所述，产地是所有品种大豆鲜味差异性的主要影响因素，但并不是所有大豆品种酸度与咸度的主要影响因素。

电子舌对70种大豆的具体味觉活度分析结果见图4。70种大豆的酸度平均值为6.24，咸度平均值为5.84，鲜度平均值为6.10。

图4 5个产地区域不同大豆品种的味觉活度值雷达图Fig.4 Radar diagrams of taste activity values of different soybean varieties from five places of origin

由图4可知，在5个产地区域中，大豆酸度平均值最高的为北方地区(6.55)，中黄大豆次之(6.02)。中黄大豆的酸度水平与其所富含的极高乙酸含量具有显著关联，同时中黄大豆中的正己醛含量(1.25%)和正己醛的贡献率(ROAV=4.46)都仅次于北方大豆(1.43%，ROAV=5.11),而北方大豆中的乙酸含量与其他地区相比并无显著优势，据此推测大豆的酸度味觉水平除了与乙酸含量相关外，还与正己醛含量具有高度相关性，大豆中的酸度水平过高会影响农产品的货期架[21]，因此，北方地区与中黄大豆相较于其他品种更不适于豆油、豆奶和豆芽等贮藏要求较高的农产品生产；同时若利用二者进行其他类农产品加工，需重点关注正己醛含量对最终产品品质的影响。

咸度平均值最高的品种来自东北吉林地区(8.80)，包括混育的JLDLW及HD；鲜度平均值最高的品种来自南方广西地区(7.78)，包括GC、GX等品种。大豆中的咸度和鲜度水平主要来源于其中的鲜味肽及水解蛋白所产生的代谢产物，这些代谢产物可以显著增强大豆的味觉丰富程度[22]，在以大豆为原料的调味制品加工中可以起到良性作用；同时东北地区与南方地区大豆的正己醇含量基本持平(见图4中B)，同为5个产地区域中最低水平，故吉林地区与广西地区大豆可作为大豆调味制品的良好籽粒原料。

3 结论

本文通过GC-QE与电子感官技术结合对5个产地区域大豆籽粒的挥发性风味物质及感官水平进行测定与比较，为大豆风味类制品原料的选取提供了参考。电子鼻与电子舌均能较好地鉴别出大豆风味和滋味活度之间的差异(P<0.01)；GC-QE在大豆中共鉴定出63种挥发性风味物质，其中有5种对大豆籽粒风味具有一定贡献作用，包括正己醛、正己醇、乙酸等大豆不良风味的来源物质及1,3-二甲基苯和3-辛醇，正己醛和3-辛醇的贡献作用尤其显著，ROAV在5个产地中的均值大于1；正己醇对国外地区大豆风味贡献作用显著，ROAV=1.06，对其余地区大豆风味贡献作用较小，ROAV<1；乙酸对南方和中黄地区大豆贡献作用较大，ROAV分别为1.06和1.81，对其余地区风味贡献作用较小，ROAV<1；1,3-二甲基苯对5个产地区域大豆的风味贡献作用极小，ROAV均不超过0.15。

北方地区大豆的正己醛含量和酸度味觉水平均为5个产地区域中最高，不推荐作为以大豆为原料的风味制品加工；东北地区大豆的正己醛及乙酸含量最低，其中吉林地区的大豆具有最高的咸度味觉水平，推荐作为优质大豆加工制品的原料；南方大豆的正己醇含量与东北地区大豆基本持平，且广西的GC与GX品种具有最高的鲜度味觉水平，推荐广西地区大豆作为优质大豆调味增鲜制品的原料；国外地区大豆的正己醇含量最高，中黄地区大豆的乙酸含量最高，正己醛、乙酸分别对国外与中黄大豆的风味影响作用最大，在使用两地大豆进行加工时应尤其注意两种物质的动态变化规律，防止产生不良风味。

本研究对大量品种大豆间的感官与风味水平进行比较，初步得到了在味觉与风味水平上具有优势的品种，为大豆制品的原料筛选方法提供了数据参考和体系构建的依据。