鸡球虫病活疫苗实验室安全性试验

吕宁宁，王宗升，马冬，邵三敏，许荣强，牛营，贾鑫玉

（青岛易邦生物工程有限公司 山东青岛 266113）

随着生活水平不断提高，鸡肉的品质也被大众所要求。家禽饲养周期短，投资成本比较小，深受广大畜牧行业投资者的喜欢。我国鸡品种种类丰富多样，鸡肉脂肪含量少，肉质鲜美，深受大众喜欢。近几年经济不断地发展，规模化养殖场越来越多，伴随着养殖场的鸡球虫病也越来越多，几乎所有养殖场深受球虫病的危害。球虫病已经给养殖场造成多达几十亿的损失。随着科研水平不断进步提高，鸡球虫活疫苗的开发研究越来越多，可以有效解决家禽动物的耐药性问题并且能够改善鸡的肌肉品质和蛋品质，对人们来说可以减少药物残留食用的危害。目前市面上球虫病的疫苗基本可以控制场内鸡球虫病的侵害，但不能完全有效的控制。鸡球虫种类较多，会出现疫苗不对型，导致球虫病无法控制。鸡球虫活疫苗从上市至今销售量一直在增长，仅Coccivac 和Immucox 在10 年之间共销售了上百亿头份[1]。本文主要对鸡球虫活疫苗的研究进展以及球虫疫苗实验室安全性试验评价等方面进行概述。

1 鸡球虫病研究进展

1.1 鸡球虫病

1）鸡球虫生物学特性及分类。

鸡球虫属于艾美耳属，有四个孢子囊，八个子孢子。球虫的生活史可分三个阶段：孢子生殖（sporogony）在宿主体外，裂殖生殖（merogony）、配子生殖（gametogony）在宿主体内[2]。Sporogony 生殖需要在湿润、有氧的条件下发育形成卵囊，未形成卵囊的孢子不具有传染性。Merogony 生殖主要是家禽在采食吸入到消化道，通过胃内容物碾磨、胃溶液、胆汁等消化释放出子孢子，从而入侵到肠道上皮细胞进行裂殖。Gametogony 生殖又叫有性生殖，裂殖子发育形成小配子体，小配子与大配子结合形成合子，发育形成卵囊，最终排出肠道。

全世界公布鸡球虫种类有14 种以上，我国大概有7 种，其中柔嫩艾美耳球虫（eimeria tenella）、毒害艾美耳球虫（eimeria necatrix）、巨型艾美耳球虫（eimeria maxima）在我国占据较多[3]。该寄生虫主要通过粪口传播感染鸡，传染源主要有水、粪便、食物等。

2）鸡球虫病流行病学。

鸡球虫病是我国第二类动物疫病，主要寄居在鸡肠道内的一种寄生虫病。鸡球虫病广泛分布于全球。发病不分季节、日龄段，各个日龄段均可发病，所有日龄均易感。鸡场内发病率高达50%，死亡率20%以上。迄今为止，大部分养殖户还是在用抗生素进行球虫治疗，导致球虫病耐药性越来越严重。

鸡球虫容易适宜外界环境，球虫卵具有坚硬且密度大的卵囊壁，可以在粪便和土壤中存在很长时间。常见的消毒剂（84 消毒液、75%酒精）常规配比无法杀死球虫，10%的氨水、烧碱等可以杀死球虫，40 ℃以上可以杀死虫卵，在干燥不潮湿的地方球虫不易生长。最常见的柔嫩艾美耳球虫主要寄生于在30 日龄左右鸡，急性聚集性暴发致死率可达100%。巨型艾美耳球虫主要发病于蛋鸡和大日龄鸡，致死率不高。

3）鸡球虫病免疫机制。

感染鸡球虫病的主要临床特征是精神沉郁、消瘦、蛋鸡产蛋率下降、血痢、死亡等。解剖观察发现内脏肠道弥散性出血、盲肠肿大充血，严重时小肠发黑坏死。一般感染7 天后症状明显。不同种类的球虫对应不同的抗原，其中巨型艾美耳球虫的抗原性最强。机体感染后主要激发机体产生细胞免疫，抵抗球虫对机体的侵害。

T 细胞介导机体产生细胞免疫应答，促进淋巴细胞分泌淋巴因子，通过吞噬细胞、NK 细胞阻止寄生虫入侵，吞噬细胞可以非特异性的吞噬子孢子和裂殖子并且参与机体免疫防御机制，做出免疫应答。体液免疫主要是通过机体产生抗体，与抗原发生中和，从而抵抗入侵。体液免疫产生IgA、IgM 和IgG，最先抵御寄生虫入侵的是IgM 但无记忆功能。当临床症状比较明显时，IgG 抗体也开始出现，第14 天抗体达到高峰，之后开始下降，IgG 抗体有较强的免疫记忆功能。

1.2 鸡球虫病疫苗

鸡球虫活疫苗研究非常广泛，目前有强毒活苗、弱毒活苗、基因亚单位疫苗和核酸DNA 疫苗。强毒活苗是自然收集虫卵从粪便和肠道中，然后培养、纯化所需的种类，按照不同球虫比例混合制成。强毒苗的缺点在于采食量降低、饲料转化率的降低，从而影响鸡的生长速度。弱毒活苗可以通过冷却、加热、辐射、化学诱导剂等物理化学的方法对虫卵进行弱化，还有可以通过鸡胚连续传代获得致病性低的活疫苗。弱毒活疫苗的缺点是传达多次后毒力恢复，遗传稳定性差。

DNA 疫苗是通过筛选出球虫的抗原基因插入到所表达的宿主载体中，构建重组表达质粒，注射到动物体内，从而刺激机体产生免疫应答。用E.tenella 的PET-TA4 重组蛋白表达的活菌免疫鸡只，攻毒后免疫组的RWG 高于对照组、卵囊产量明显低于攻毒组。DNA 疫苗自身免疫安全，制备高效简单，缺点是可能出现基因突变与免疫耐受等。基因亚单位疫苗是去除抗原中有害基因，只保留其抗原性，进行母源免疫获得抗体。亚单位疫苗可以通过肌肉免疫激发机体产生抗体。

2 鸡球虫病活疫苗安全性试验

2.1 试验方法

运用一次单剂量接种试验、单剂量重复接种试验和一次超剂量接种试验三种类型进行实验，并设立空白对照组。注射疫苗种类方式、饲养方式、饲料品种、鸡品种健康状况严格执行一致。不同组别分开饲养，按规定时间进行接种。按照中国农业农村部颁发的《兽用生物制品实验室安全试验技术指导原则》进行安全性检测，为该疫苗的临床应用提供依据。

单剂量接种试验一般是在雏鸡出生4 d 后接种一次，计量按照疫苗说明书最适量进行注射，接种后每天观察鸡情况并记录并且在第7 天和第14 天进行称重、剖检。单剂量重复接种试验是在雏鸡出生4 d 后接种第一次，间隔14 d 后接种第二次，接种后每天观察鸡情况并记录并且在第7 天和第14 天进行称重、剖检。一次超剂量接种试验是按照疫苗说明书最适剂量的10 倍、20 倍、40 倍、100 倍进行接种，接种后每天观察鸡情况并记录并且在第7 天和第14 天进行称重、剖检。

2.2 安全性效果评价指标

鸡球虫疫苗接种开始后，每日对鸡的精神状况、采食情况、接种部位情况、呼吸情况、粪便收集、鸡死亡情况等进行观察并记录。对试验期间鸡的体重和体温进行记录。接种后第7 天和14 天进行剖检，对内脏器官（心、肝、脾、肺、肾、肠道）、免疫器官（法氏囊）、注射部位的肌肉进行物理方法肉眼观察。并取十二指肠、空肠、回肠、盲肠等相对应的内脏组织进行切片染色观察（10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红染色，显微镜下观察）。测定实验鸡的生长性能以及肌肉品质性状。

2.3 鸡球虫病疫苗安全性评价结果

一次单剂量接种试验鸡群表现正常，鸡群不会出现死亡、体重下降现象。剖检肠道病少见，一般会出现肠道增生出血，十二指肠个别会出现少量白色结节，盲肠极个别会出血；肠道黏膜内能够找到少量球虫；其余器官未发生病变，在器官中未找到球虫以及虫卵[4]。与空白对照组相比较无差异。在对肠道组织进行石蜡切片、包埋、HE 染色、显微镜下染色镜检观察，并未发现肠道黏膜脱落，肠道正常，其余器官组织也无明显病变。表明一次单剂量接种对鸡无异常情况表现，对鸡安全。

单剂量重复接种试验在实验过程中鸡群表现正常，一般也不会出现死亡。第二次接种7 天后剖检观察，十二指肠出现少量白色结节、空肠胀气、盲肠有出血点，其余器官组织无明显可见病变。显微镜下观察发现，十二指肠出现黏膜断裂、脱落，肠道内出现大量的虫体，并在小肠内黏膜固有层看到虫体和虫卵。表明单剂量重复接种对鸡无异常情况表现，无肉眼可见病变，对鸡安全。

一次超剂量接种试验在实验中，100 倍超剂量接种后第二天就出现精神沉郁、采食量下降，一周出现死亡。其余倍数剂量无明显症状，镜检下观察十二指肠黏膜严重脱落，出现大量白色结节，肠黏膜出血。黏膜固有层出现大量球虫和虫卵，并有淋巴细胞和嗜酸性粒细胞出现。个别鸡出现肝脏肿大、心肌纤维肿大、肾小管肿大坏死，采食量与日增重均下降。一次超剂量接种对鸡出现肉眼可见生理反应，出现临床症状，同时机体出现防御抵抗炎症反应的嗜酸性淋巴细胞。

3 讨论

安全性实验旨在评价疫苗的安全使用性，为生产临床提供基础评价指标。目前市面上出现的鸡球虫病三价活疫苗（柔嫩+毒害+巨型艾美耳球虫三种）、鸡球虫病四价活疫苗（柔嫩+堆型+巨型+毒害艾美耳球虫四种），通过分离、纯化、培养、弱化后得到疫苗。

鸡球虫的免疫抗体水平在一定条件下会随着接种鸡球虫活疫苗的剂量而增加[5]。球虫抗体水平随着时间的延长而降低，二次免疫会再次激发机体的免疫记忆，提升机体的抗体水平且持续时间长。选择小日龄接种鸡球虫疫苗，由于幼禽免疫系统发育不够完善，不能够产生足够的抵抗能力。选择大日龄的鸡，不能够在球虫高发期机体获得高水平抗体水平，导致鸡场球虫大面积暴发。王丽[6]研究结果显示，Eimeria Tenella 和Eimeria acervulina 活疫苗株两次免疫间隔时间为7～11 d，雏鸡能够获得很好的抗体免疫力。■