马立克氏病病毒活载体疫苗的研究进展

王子书

（徐州市贾汪区畜牧兽医站 江苏徐州 221011）

马立克氏病（marek's disease，MD），是当前危害养鸡业健康发展的主要禽类传染病之一，是由马立克氏病病毒（marek's disease virus，MDV）引起的一种高度接触性肿瘤病，以外周神经、虹膜、性腺、肌肉、各种内脏器官和皮肤等处形成淋巴肿瘤为主要特征[1,2]。目前，MDV 已发现的有3 个血清型，即致病性的血清I 型（MDV-1），根据其毒力分为弱毒株（mMDV）、强毒株（vMDV）、超强毒株（vvMDV）和特超强毒株（vv+MDV）[3]；血清II 型（MDV-2）是非致瘤性的自然弱毒株；血清III 型（MDV-3）是火鸡疱疹病毒（herpes virus of turkey，HVT）。其中，血清I 型中的vvMDV 和vv+MDV 的一些野毒株能在免疫过CVI988/Rispens 株的鸡群中引发严重的疾病。MDV 的主要宿主是鸡，传染源为病鸡和带毒鸡，病毒从羽毛囊中排出，经呼吸道侵入机体内。MD 病程较长，雏鸡易感，死亡率较高，目前针对MD 尚无特效治疗药物，但已研发了有效的商品疫苗。但随着MDV 毒力的不断增强，其流行及危害也不断上升，严重损害养鸡业的经济效益。因此，研发安全有效的疫苗迫在眉睫。

疫苗包括传统疫苗和新型疫苗。目前传染病流行情况复杂，抗原变异迅速，灭活疫苗只能诱导体液免疫，且接种剂量大，需添加佐剂，成本过高，在灭活的过程中，还可能存在灭活不完全、病毒逃逸等风险。弱毒疫苗虽产生免疫力快，但存在致弱毒株毒力返强的风险，还可能加剧病毒的变异[4]。随着基因工程技术的发展，用活病毒作载体来表达异源基因的重组活载体疫苗为当前疫苗研究的热点。基因工程重组活载体疫苗是利用基因工程技术将一种或几种病原的保护性抗原基因插入到活载体中并使之在体内表达出保护性抗原的活疫苗[5]。该类疫苗不仅免疫效力高，能够诱导机体产生的免疫比较广泛，还兼具成本和安全优势，能同时表达多个外源基因可制成多价或多联疫苗，达到一针防多病的目的，简化免疫程序，能克服不同病毒弱毒苗间产生的干扰现象，减轻了动物的应激反应，具有广泛的应用前景，是当今及未来疫苗研发的主要方向之一。

1 MDV 作为疫苗载体的优势

MD 作为可用疫苗预防的肿瘤性疾病，接种疫苗是有效控制MD 的主要手段。HVT 是最早能安全有效控制MD 的疫苗，MDV-2用作疫苗的保护力较低，但将HVT 和MDV-2 联合应用时，产生的保护效力会提升，这种保护性协同作用已被证明对MDV-2 和MDV-3 组合具有特异性，但不适用于MDV-1 和MDV-2，因此，MDV-2 病毒通常用于二价或三价疫苗制剂[6]。自20 世纪70 年代以来，HVT、HVT+SB-1 双价疫苗、CVI988/Rispens 株弱毒活疫苗和814 疫苗等都曾先后成为有效预防MD 的疫苗。基因工程技术为开发MD 疫苗提供了新路径，MDV 属于α-疱疹病毒，是大分子DNA病毒，其弱毒株可作为表达外源基因的病毒载体[7]。MDV 作为载体目前受到广泛关注，它有以下优点：①MDV 载体疫苗可胚内或1 日龄接种，诱导早期免疫保护，并且产生较长时间的免疫反应，有利于外源蛋白的持续表达，免疫保护效果较为理想；②MDV 基因组庞大，可插入多个或较长的外源基因，有利于构建多价或多联重组活载体疫苗，而且遗传稳定；③MDV 为细胞结合型病毒，可突破母源抗体的干扰；④MDV 载体疫苗既能预防MD，还可预防其他的病毒性家禽疾病，且MDV 的自然宿主仅限于禽类，对其他家畜和人类是安全的[8]。

2 病毒载体的构建方法

目前构建MDV 重组活载体疫苗主要采用的是同源重组法（homologous recombination，HR）和细菌人工染色体法（bacterial artificial chromosome，BAC）。因MDV 基因组庞大，利用同源重组法构建过程繁杂，效率较低。随着分子生物学技术的发展,利用BAC 技术，通过同源重组法将BAC 载体功能序列mini-F 插入到病毒基因组中的某个位点，用获得的重组病毒基因组DNA 转染细胞，采用有限稀释法纯化出重组病毒[9]。该方法可以方便地在体外操作，而且具有遗传稳定、容量大、操作简单等优点，应用前景十分广阔。但BAC 自身的序列难以去除，导致获得的重组病毒带有非必要的外源基因序列，存在安全隐患。除了以上两种方法，目前采用的还有Fosmid多片段拯救系统、CRISPR/Cas9 系统等基因编辑技术。CRISPR/Cas9与同源重组和BAC 技术的优势在于操作简便、成本低及无外源基因干扰等。

3 MDV 活载体疫苗的研究进展

近年来，国内外研究人员都在致力于重组MDV 活载体疫苗的研制，多家实验室已经成功构建了重组MDV 疫苗。HVT 是构建表达外源抗原基因重组活载体疫苗和诱导产生保护性免疫最有效的载体之一，普遍使用的方法是将HVT 基因组克隆到黏粒（cosmid）或细菌人工染色体（BAC）中，利用反向遗传操作，使其他病毒的保护性抗原基因能够快速定向性地插入到HVT 基因组中[10]。用HVT重组病毒表达MDV-1 抗原的优点是二者有交叉抗原反应且HVT在鸡体内维持时间长，因此可用大量的HVT 蛋白来诱导免疫反应[11]。由于HVT 的疫苗生产成本低，可冻干，使用方便，易于保存和运输；同时，HVT 对鸡无致病性，不产生任何副作用，也不发生水平传播，从而降低了重组活载体疫苗散毒的风险。例如，以HVT 为载体构建表达MDV gB 基因的重组病毒，具有MDV-HVT 二价苗优点的同时更安全且易保存。1992 年Nilkura 等[12]以HVT 为载体，构建出表达MDV gB 基因的重组病毒在保证安全性的基础上保留了与HVT 同等的免疫效果。研究表明，与传统IBDV 疫苗相比，rHVT-VP2 重组疫苗对预防鸡传染性法氏囊病十分有效，不仅对法氏囊没有损害，而且在含有母源抗体的鸡中也能诱导产生很好的免疫保护效果，在国内外市场取得了巨大成功，已作为商业化疫苗广泛应用于商品鸡中。此外，研究表明MDV-2 和HVT 疫苗之间存在协同保护作用，因此将MDV-2 用作载体前景广阔[13]。

然而，由于MDV 毒力不断增强，HVT 防控效果正在减弱，利用MDV-1 疫苗作为载体更具有现实意义。20 世纪90 年代，MDV-1开始作为表达IBDV、NDV、AIV 的载体。1999 年，有学者[14]采用CVI988 疫苗株为载体，构建了表达IBDV VP2 基因的重组MDV 疫苗，对MD 和IBD 有较强保护力。Cui 等[15]以MDV-1 为载体构建的rMDV-HA 重组疫苗获得了比以HVT 为载体的rHVT-HA 重组疫苗更好的免疫保护效果。李凯[16]用MDV-1 弱毒疫苗株814 作为载体，构建表达IBDV VP2 基因的重组MDV 活载体疫苗有望成为一种可以同时高效预防IBDV 和MDV 的二联活疫苗。近年来，国内多家实验室利用MDV 的常规疫苗成功构建了多个重组MDV 疫苗。

4 结论与展望

多数研究表明，活载体疫苗的研究和应用具有广阔的开发前景。基因重组活载体疫苗有望成为今后控制MD 的主要疫苗，关于重组MDV 活载体疫苗的研究进展明显，多种病原体保护性抗原在MDV 载体中成功表达，部分重组MDV 活载体疫苗已取得兽药证书，为进一步控制MD 提供可能。但也存在一些局限性。例如，哪些病毒基因与免疫或毒力有关，以及必须表达哪些基因组合才能生产出有效的疫苗，目前的知识尚且有限，还需要更多研究。此外，对MDV 的先天性和适应性免疫反应以及现有疫苗的保护机制还不是完全了解，对涉及MDV 在感染和传播中的基因也需要更加深入地了解[17]。为构建出理想的MDV 重组疫苗，不仅要考虑影响重组疫苗效果的关键因素，例如抗原基因、病毒载体、插入位点等方面的选择，还要兼顾生物安全性，因此常规使用的疫苗株是构建MDV 载体的最佳选择。未来基因重组活载体疫苗的发展应该以提高疫苗的安全性与靶向性为主要方向，为畜禽等动物传染性疾病防治以及食品安全提供重要保障。■