食管癌根治术患者血清microRNA-27a、microRNA-203a-3p表达及与预后的关系*

杨金华，赵天增，张岭

（南阳医学高等专科学校第一附属医院 普胸外科，河南 南阳 473058）

食管癌是常见的消化系统恶性肿瘤，全球每年新发60.4 万例，死亡54.4 万例[1]。食管癌的病理类型包括鳞癌、腺癌等，其中食管鳞癌是最主要的病理类型，占所有类型的90%以上。目前根治性切除为食管癌的治愈性治疗手段，但部分患者治疗后仍会发生肿瘤复发及转移，导致患者死亡[2]。因此，寻找能够预测食管癌患者根治术后预后的肿瘤标志物具有重要临床价值。microRNA（miRNA）是单链非编码RNA，能够通过结合靶基因mRNA，调控下游基因的表达，与人类感染、炎症及肿瘤等多种疾病的发生、发展密切相关[3]。microRNA-27a（miR-27a）编码基因位于19p13.12。近年来研究发现，miR-27a 在Wilms瘤[4]、非小细胞肺癌[5]等恶性肿瘤组织中的表达异常上调或下调，其通过影响下游癌基因，如前列腺、乳腺过表达因子1 的表达，促进肿瘤增殖、迁移及侵袭等，导致肿瘤恶性进展。microRNA-203a-3p（miR-203a-3p）编码基因位于14q32.33。近年来研究发现，miR-203a-3p 能够调控转录因子Slug 的表达，促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，参与促进乳腺癌[6]，胰腺癌[7]等恶性肿瘤的侵袭及转移，导致患者预后不良。目前食管癌患者术前血清miR-27a、miR-203a-3p 表达及与术后预后的关系报道较少。基于此，本研究通过检测食管癌根治性切除术患者术前血清miR-27a、miR-203a-3p 的表达，探讨其对预后的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016 年3 月—2017 年3 月南阳医学高等专科学校第一附属医院行食管癌根治术治疗的123 例食管癌患者作为研究组。纳入标准：①接受食管癌根治术，术后经病理组织学检查诊断为食管鳞癌；②初次诊治，既往无放化疗史；③临床资料和随访资料完整。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②合并严重心肺功能障碍；③合并精神障碍性疾病或妊娠哺乳期妇女。其中，男性85例，女性38例；年龄41～66岁，平均（55.39±6.27）岁；TNM 分期：Ⅰ、Ⅱ期69 例，Ⅲ期54 例；肿瘤分化程度：高中分化75 例，低分化48 例；肿瘤位置：上胸段29 例，中胸段55 例，下胸段39 例；有淋巴结转移42 例，无淋巴结81 例。另取同期本院健康体检人群64 例作为对照组。其中，男性50 例，女性14 例；年龄43～64 岁，平均（54.26±5.98）岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05）。本研究经医院医学伦理委员会批准通过，患者及家属均签署知情同意书。

1.2 仪器与试剂

ABI7500 型实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRTPCR）仪（美国ABI 公司），TRIzol 试剂盒（美国赛默飞公司），逆转录试剂盒（M-MLV）、qRT-PCR 试剂盒购自北京索莱宝公司。

1.3 qRT-PCR 检测血清miR-27a、miR-203a-3p的表达

留取研究组入院次日和对照组查体时空腹静脉血约5 mL，3 000 r/min 离心10 min，取上层血清，置入-80℃冰箱冷冻保存。采用TRIzol 试剂盒提取血清总RNA，逆转录为cDNA，进行qRT-PCR 反应。反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共计40个循环。总反应体系10 μL：cDNA 1μL，正反向引物各1 μL，SYBR green Master Mix 5 μL，ddH2O 2 μL。引物由上海生工生物工程股份有限公司设计合成。miR-27a 正向引物：5'-AT GGTTCGTGGGTTCACA-3'，反向引物：5'-GTGGCTA AGTTCCGACG-3'，长度分别为18 bp 和17 bp；miR-203a-3p 正向引物：5'-ATCATCCCTGCATCCACT-3'，反向引物：5'-ATCCACGACGGACACATT-3'，长度均为18 bp。以U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算血清miR-27a、miR-203a-3p 相对表达量。

1.4 随访

所有患者连续随访5 年，第1 年每3 个月随访1 次，第2 年每半年随访1 次，第3～5 年每年随访1 次。以门诊或电话方式随访，截止日期为2022 年4 月1 日。随访终点为患者死亡或随访时间结束。

1.5 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（）表示，比较用t检验或方差分析；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log rank χ2检验；影响因素的分析用单因素或多因素Cox 回归模型；P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组血清miR-27a、miR-203a-3p 相对表达量比较

研究组血清miR-27a、miR-203a-3p 相对表达量分别为（3.09±0.45）、（2.79±0.37），对照组分别为（0.88±0.16）、（0.78±0.24）。两组血清miR-27a、miR-203a-3p 相对表达量比较，差异有统计学意义（t=38.017 和39.339，均P=0.000），研究组高于对照组。

2.2 不同临床病理特征食管癌患者根治术前血清miR-27a、miR-203a-3p相对表达量比较

不同肿瘤分期、分化程度和是否淋巴结转移食管癌患者根治术前血清miR-27a、miR-203a-3p 相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05），肿瘤分期Ⅲ期、分化程度低分化、有淋巴结转移食管癌患者根治术前血清miR-27a、miR-203a-3p 相对表达量高于肿瘤分期Ⅰ、Ⅱ期、分化程度高中分化、无淋巴结转移患者。不同年龄、性别及肿瘤位置食管癌患者根治术前血清miR-27a、miR-203a-3p 相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 不同临床病理特征食管癌患者根治术前血清miR-27a、miR-203a-3p相对表达量比较

2.3 食管癌患者术前不同血清miR-27a、miR-203a-3p表达与预后的关系

123 例患者随访过程中死亡80 例，以血清miR-27a 相对表达量平均值3.09 为界，分为miR-27a 高表达组（miR-27a ≥ 3.09）和miR-27a 低表达组（miR-27a <3.09），分别有62 例和61 例。miR-27a 高表达组患者5 年总生存率为16.13%（10/62），miR-27a 低表达组为54.10%（33/61），经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=19.496，P=0.000），miR-27a 高表达组低于miR-27a 低表达组。以血清miR-203a-3p 相对表达量平均值2.79 为界，分为miR-203a-3p 高表达组（miR-203a-3p ≥ 2.79）和miR-203a-3p 低表达组（miR-203a-3p <2.79），分别有60 例和63 例。miR-203a-3p 高表达组患者5 年总生存率为18.33%（11/60），miR-203a-3p 低表达组为50.79%（32/63），差异有统计学意义（χ2=14.241，P=0.000），miR-203a-3p高表达组低于miR-203a-3p 低表达组。见图1。

图1 食管癌患者术前不同血清miR-27a、miR-203a-3p表达与预后的生存曲线

2.4 影响食管癌患者预后的Cox回归分析

以年龄（<60 岁=0，≥ 60 岁=1）、性别（女=0，男=1）、肿瘤位置（下胸段=0，上、中胸段=1）、分化程度（高、中分化=0，低分化=1）、淋巴结转移（无=0，有=1）、肿瘤分期（Ⅰ、Ⅱ期=0，Ⅲ期=1）、miR-27a（<3.09=0，≥ 3.09=1）、miR-203a-3p（<2.79=0，≥ 2.79=1）为自变量（引入水准为0.05，剔除水准为0.10），以是否死亡为因变量（否=0，是=1）。进行单因素Cox 回归分析。结果显示：肿瘤分期[=1.730（95% CI：1.434，2.099）]、淋巴结转移[=1.602（95% CI：1.191，2.153）]、miR-27a [=2.041（95% CI：1.813，2.463）]、miR-203a-3p [=2.060（95% CI：1.921，2.279）]是食管癌患者预后的影响因素（P<0.05）。见表2。

表2 影响食管癌患者预后的单因素Cox回归分析参数

3 讨论

我国每年新发食管癌约24 万例，达全球发病例数的50%以上[8]。食管癌早期症状不明显，当出现吞咽困难等临床表现时已处于中晚期，即使行积极根治性手术等治疗后，术后复发率和病死率仍较高[9]。目前临床上主要依据肿瘤分期、淋巴结转移等临床病理学指标评估食管癌患者的临床预后，但由于肿瘤异质性，不同患者预后仍然存在一定差异[10]。因此，寻找评估食管癌预后的肿瘤标志物，对患者的个体化治疗，具有重要临床意义。

miRNA 是长度为20～24 个核苷酸的非编码RNA，成熟的miRNA 被整合到RNA 诱导的沉默复合物中，通过不完全碱基配对来识别靶基因mRNA，抑制靶基因mRNA 的翻译，参与真核生物基因表达的转录后调控。miR-27a 是近年来发现的新miRNA，其通过调控机体代谢，免疫等功能，与心力衰竭[11]、糖尿病[12]等疾病关系密切。本研究中食管癌患者血清miR-27a 表达明显升高，提示miR-27a 参与食管癌的肿瘤发生。有研究表明，长链非编码RNA TUG1 能够作为分子海绵与miR-27a 相互作用，抑制miR-27a 的表达，肿瘤发生时TUG1 表达下调，导致miR-27a 表达升高，促进下游肿瘤坏死因子-α 的表达，促进肿瘤发生[13]。此外，肿瘤发生过程中由于细胞过度增殖，处于缺氧状态，缺氧能够诱导肿瘤细胞缺氧诱导因子1α 的表达，促进miR-27a 的表达[14]。本研究中，血清miR-27a 表达与肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移有关，表明miR-27a 参与促进食管癌进展。有研究表明，miR-27a 可以靶向并负调节膜相关鸟苷酸激酶2，上调磷脂酰肌醇2 激酶/Akt 信号通路，促进程序性死亡配体1 的表达，促进免疫逃避，导致肿瘤进展[15]。本研究中，血清miR-27a 高表达患者生存预后较差，是影响食管癌患者生存预后的独立因素。提示血清miR-27a 可能作为新的肿瘤标志物，有助于判断患者的临床预后。有研究发现，肿瘤组织miR-27a 表达上调能够增强mTOR 信号传导，促进肿瘤细胞糖酵解，导致肿瘤细胞化疗耐药性形成，导致患者不良预后[16]。

miR-203a-3p基因位于14 号染色体，具有1 个外显子，其可通过调控下游靶基因，如细胞内信号转导分子1 的表达，参与细胞增殖、分化等过程的调节[17]。本研究中，食管癌患者血清miR-203a-3p 表达明显上调，提示miR-203a-3p 参与食管癌的肿瘤发生。分析其原因可能与环状RNA 的表达调控有关。有研究发现，环状RNA 43280 作为肿瘤抑制因子，能够作为内源竞争性RNA，抑制miR-203a-3p 的表达，肿瘤发生时环状RNA 43280 表达下调，导致miR-203a-3p 表达升高，孕激素和脂联素分子受体3 过度激活，促进肿瘤增殖[18]。本研究中，血清miR-203a-3p 的表达与肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移有关，表明miR-203a-3p 参与促进食管癌的恶性进展。既往研究发现，食管癌肿瘤细胞ECA109 中miR-203a-3p 表达显著升高，并能够负调控C 末端结合蛋白2 的表达，促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，上皮性标志E-钙黏素表达升高，间质性标志波形蛋白表达升高，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[19]。本研究中，血清miR-203a-3p 高表达是患者不良预后的独立因素。既往研究表明，miR-203a-3p 表达升高通过促进肿瘤细胞发生上皮间质转化，增强肿瘤细胞对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的耐药性，miR-203a-3p 高表达患者靶向治疗的无进展生存期明显缩短[20]。

综上所述，食管癌患者根治术前血清miR-27a、miR-203a-3p 表达升高，两者表达与肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移有关，是影响食管癌患者生存预后的独立因素，将来有希望成为评估食管癌患者术后预后的肿瘤标志物。但本研究尚存在一定的不足之处，由于样本量有限，未能对食管癌患者进行分层分析，并且两者食管癌中具体作用机制尚不清楚，需今后进行深入研究。