甲基化芯片技术检测粪便DNA甲基化在海南地区少数民族人群大肠癌筛查中的应用*

刘倩，王振奋，黄平

（海南省人民医院 1.胃肠外二科 2.肛肠外科，海南 海口 570311）

大肠癌包括直肠癌、结肠癌，早期无特异性症状，>60%大肠癌确诊时已处于中晚期[1]。因此，早筛查、早诊断是抑制大肠癌病情进展、减少不良预后的关键。目前，临床针对大肠癌的早期诊断技术包括肠镜检查、大便隐血试验、基因突变检测等，虽可一定程度上提升大肠癌的早期检出率，但仍存在一定不足，如肠镜检查属于侵入性操作、大便隐血试验特异性低、基因突变的位点不固定等[2-4]。DNA甲基化是表观遗传学中常见的调节基因表达方式，在胚胎发育、遗传印记与维持正常细胞功能等方面发挥关键作用[5]。SIDRANSKY 等[6]于1992 年在结直肠癌患者粪便中检测到突变的KRAS基因，首次证实粪便DNA 甲基化检测方法的可行性。随后不断有研究报道，粪便中基因异常甲基化可有效检出大肠癌，但理想生物标记物的确定尚存在一定争议[7]。国内有研究发现，少数民族比汉族更易患大息肉（直径>9 mm）且更易癌变，少数民族结直肠癌的恶性程度比汉族更高、预后更差，发病年龄比汉族早[8]。海南省位于中国最南端，是1 个由汉族、黎族、苗族、回族等37 个民族组成的省份，少数民族人口约164.42 万，占全省总人口的18.11%（居全国前10位）。少数民族生活方式、生活环境与风俗习惯与其他地区存在很大差异，但目前关于海南地区少数民族大肠癌的筛查与流行病学数据稀缺。本研究通过VAV3、IKZF1、RIMS1基因分析甲基化芯片技术检测粪便DNA 甲基化在海南地区少数民族人群大肠癌筛查中的应用价值，旨在为大肠癌的无创筛查提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020 年6 月—2022 年6 月海南省人民医院就诊的大肠癌高危少数民族人群102 例。其中男性56例，女性46例；年龄43～77岁，平均（59.63±5.82）岁；体质量指数19.62～29.59 kg/m2，平均（23.57±2.75）kg/m2；黎族39 例，苗族30 例，回族25 例，其他8 例。纳入标准：①海南地区少数民族人群；②年龄30～80 岁；③符合《中国早期结直肠癌及癌前病变筛查与诊治共识》[9]得大肠癌高危人群标准；④大便潜血阳性或大肠癌危险因素调查问卷阳性；⑤收集粪便前1 周内肠道未接受灌肠、结肠镜检查等侵入性操作；⑥未接受任何抗肿瘤治疗；⑦自愿签署知情同意书。排除标准：①因直肠畸形、肛门畸形或高度狭窄而致结肠镜无法插入；②伴有严重下消化道梗阻、切口疝、腹部疝气或可疑结肠穿孔；③肝功能急性衰竭或慢性衰竭；④肠镜检查禁忌证；⑤精神障碍、认知障碍等。另选取同期本院招募30 例健康志愿者作为对照组，肠镜下所见结直肠黏膜无明显病变。对照组中男性17 例，女性13 例；年龄41～80 岁，平均（60.02±4.96）岁；体质量指数18.86～28.42 kg/m2，平均（22.68±2.43）kg/m2；黎族12 例，苗族8 例，回族7 例，其他3 例。两组一般资料比较，差异无统计学意义（P>0.05），可对比。

1.2 方法

1.2.1 粪便标本采集、保存 首先给予受试者大便潜血定量检测专用采便管及“长安心”特定试剂盒（广州市康立明生物科技有限责任公司），研究人员严格按照产品说明书对受试者进行培训。每个受检者按要求取5～10 g 粪便并置于“长安心”粪便保护液中常温保存，标本随机编号，并进行肠镜检查，粪便标本采集、肠镜检查及组织病理检查，操作标准按照《中国消化内镜活组织检查与病理学检查规范专家共识（草案）》[10]进行。

1.2.2 甲基化芯片技术检测粪便DNA甲基化 ①甲基化芯片设计。通过查阅以往文献，发现VAV3、SDC2、ITGA4、RIMS1、NDRG4、WIF-1、HPP1、IKZF1、TFPI2等基因启动子甲基化在检测大肠癌中均表现出较高的阳性率[11-14]，并筛选出VAV3、RIMS1、IKZF1基因，针对其高甲基化位点设计探针，制作甲基化芯片。②检验芯片工作状态。根据亚硫酸氢盐修饰试剂盒（广州市康立明生物科技有限责任公司）说明书进行甲基化修饰，修饰时间为3.5 h 左右，修饰后测序验证芯片检测甲基化的敏感性，评估芯片工作状态。③提取DNA。取200 mg 左右粪便，按照粪便DNA 提取试剂盒（广州市康立明生物科技有限责任公司）说明书提取DNA，用Nano-300 微量分光光度计（广州市康立明生物科技有限责任公司）测定DNA 浓度。将DNA 保存在AE 缓冲液（200 μL）中，并置于-20℃冰箱中保存待测。④重亚硫酸氢盐钠转化DNA。⑤荧光标记、Linker-PCR 扩增靶基因。⑥扩增靶序列与芯片杂交。⑦检测杂交结果，评估甲基化状态。

1.2.3 肠镜检查 粪便DNA 甲基化筛查后2 周内接受肠镜检查，由经验丰富的肠胃科医师按照《中国消化内镜活组织检查与病理学检查规范专家共识（草案）》[10]执行肠镜检查，要求肠镜进入深度达回盲部，并观察大肠癌/腺瘤/增生性息肉、腺瘤与病灶的大小、位置等。对所有可见病变进行活检，留取标本送至病理科制作切片，进一步明确诊断。

1.3 观察指标

①粪便DNA 中VAV3、RIMS1、IKZF1基因甲基化状态；②粪便DNA 中VAV3、RIMS1、IKZF1基因单独及联合检测甲基化率，评估大肠癌、腺瘤的诊断效能。计算公式：敏感性=a/（a+c）、特异性=d/（b+d）、准确率=（a+d）/a+c+b+d、阳性预测值=a/（a+b）、阴性预测值=d/（c+d）。见表1。

表1 诊断效能评估

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肠镜病理结果

肠镜病理结果显示，102 例患者中大肠癌52 例，腺瘤28 例，增生性息肉22 例，并分别作为大肠癌组、腺瘤组和增生性息肉组。

2.2 各组粪便DNA 中VAV3、IKZF1、RIMS1 基因单独及联合检测甲基化率比较

各组粪便DNA 中VAV3、IKZF1、RIMS1基因单独及联合检测甲基化率比较，差异有统计学意义（P<0.05），大肠癌组高于腺瘤组、增生性息肉组、对照组。腺瘤组与增生性息肉组VAV3、IKZF1、RIMS1基因单独及联合检测甲基化率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 各组粪便DNA中VAV3、IKZF1、RIMS1基因单独及联合检测甲基化率比较 例（%）

2.3 粪便DNA 中VAV3、IKZF1、RIMS1 基因单独及联合检测大肠癌的诊断效能

将肠镜病理结果作为金标准，粪便DNA 中VAV3、IKZF1、RIMS1基因联合检测大肠癌的特异性、敏感性、阴性预测值、阳性预测值、准确率最高，分别为 100.00%、92.31%、92.59%、100.00% 和96.08%。见表3、4。

表3 粪便DNA中VAV3、IKZF1、RIMS1基因甲基化单独及联合检测与肠镜病理结果对比 例

表4 粪便DNA中VAV3、IKZF1、RIMS1基因单独及联合检测大肠癌的诊断效能

2.4 粪便DNA 中VAV3、IKZF1、RIMS1 基因单独或联合检测腺瘤的诊断效能

将肠镜病理结果作为金标准，粪便DNA中VAV3、IKZF1、RIMS1基因联合检测腺瘤的特异性、敏感性、阴性预测值、阳性预测值、准确率最高，分别为97.30%、71.43%、90.00%、90.91%和90.20%。见表5、6。

表5 粪便DNA中VAV3、IKZF1、RIMS1基因单独及联合检测甲基化与肠镜病理结果对比 例

表6 粪便DNA中VAV3、IKZF1、RIMS1基因单独及联合检测腺瘤的诊断效能 %

3 讨论

由于粪便样本的抑制性成分多且成分复杂，甲基化基因片段含量低，甲基化特异性PCR、甲基化测序等传统基因甲基化检测方式可能难以准确定量、定性检测粪便中的甲基化基因[15-17]。DNA 甲基化芯片技术是一种基于二代测序技术的定量定性检测技术，利用双色荧光分别标记扩增产物，再在基因芯片上杂交，最后通过荧光密度比值的高低筛选出差异甲基化基因[18-19]。该技术具有微型性、自动性、高通量性等特点，且可实现对整体甲基化水平的精细研究。KUHMANN 等[20]利用DNA 甲基化芯片技术测定大肠癌患者231 个DNA 修复基因，结果显示，不同人种间大肠癌患者的DNA 甲基化转移酶3A 基因及连接酶4 基因、基质金属蛋白酶9 基因等均出现高甲基化，且连接酶4 基因启动子区的高甲基化达60%的患者比例高达51%。朱慧萍等[21]研究报道，在大肠癌早期筛查中，甲基化芯片技术检测粪便DNA 甲基化的检出率高于大便隐血试验、血清癌胚抗原检测。进一步证实，甲基化芯片技术可提高粪便DNA 甲基化的检出率，其原因可能在于DNA 甲基化芯片技术通过酶切富集启动子与CpG 岛区域，并实施Bisulfite 测序，可提高检测全基因组DNA 甲基化状态的分辨率与测序数据的利用率，因此该技术的DNA 甲基化检出率高于传统的大便隐血试验、甲基化特异性聚合酶链反应法。

通过查阅以往文献，发现VAV3、SDC2、ITGA4、RIMS1、NDRG4、WIF-1、HPP1、IKZF1、TFPI2等基因启动子甲基化在检测大肠癌中均表现出较高的阳性率[11-14]，并筛选出VAV3、RIMS1、IKZF1基因纳入本研究。其中VAV3 蛋白具有多个功能域，可参与细胞转化、细胞骨架组织与癌基因等调控过程中。ZHANG 等[22]研究发现，KCNJ12、VAV3-AS1、EVC 联合诊断大肠癌分期的AUC、敏感性、特异性分别为0.87、83.0%和71.2%。IKZF1基因属于锌指DNA 结合蛋白家族，其主要功能在于调节细胞分化。YOUNG 等[23]采用实时荧光聚合酶链反应测定184 例大肠癌与616 例腺瘤患者血浆IKZF1、BCAT1甲基化表达，结果显示，IKZF1联合BCAT1甲基化诊断大肠癌、腺瘤的敏感性分别为71.2%和22.9%。杨葳等[24]研究发现，结直肠癌患者血液中IKZF1单基因甲基化阳性率为46.00%，与IRF4、SEPT9、BCAT1基因联合可有效提升结直肠癌检出率。RIMS1基因属于RAS基因超家族成员之一，该基因突变可造成直肠癌、肺癌等恶性肿瘤细胞增殖、转移。夏晨静[12]研究发现，IKZF1、RIMS1基因启动子甲基化在结直肠癌中具有较高的特异性与阳性率，有助于发现癌前病变。本研究结果显示，52 例大肠癌粪便中VAV3、IKZF1、RIMS1基因甲基化分别检出41 例、42 例和41 例，甲基化率均超过75.00%。28 例腺瘤患者粪便中上述3 个基因启动子DNA 甲基化率分别为32.14%、17.86%、46.43%，对照组中仅检出1 例RIMS1基因甲基化，表明VAV3、IKZF1、RIMS1基因甲基化状态改变与大肠癌发生、发展有关，有望作为大肠癌检测的新型筛查指标。大肠癌的发生、发展属于一种多阶段、多步骤、多基因参与的过程，是由正常结肠黏膜上皮细胞通过表观遗传学、遗传学的异常积累后形成[25-26]。因此，没有一种基因在所有大肠癌癌变过程中是通用的，单个基因检测存在敏感性低等缺点。诸多学者致力于研究粪便多基因联合检测，以寻找1 个检测大肠癌性能理想、消耗低的生物标记组合。本研究结果发现，VAV3、IKZF1、RIMS1基因联合检出大肠癌、腺瘤、增生性息肉的阳性率分别为92.31%、71.43%和45.45%，且诊断大肠癌、腺瘤的敏感性、准确率均较高，但特异性未见明显提高，提示联合检测可提升大肠癌筛查准确率，但可能不是最优的基因组合方式。因此后期需进一步扩大样本量，并筛选不同的基因组合，以保障特异性、敏感性均处于较高水平。

综上所述，甲基化芯片技术提示海南地区少数民族人群大肠癌患者粪便中VAV3、IKZF1、RIMS1基因表现出较高的甲基化水平，且联合检测可提升大肠癌、腺瘤的诊断效能。相信随着基因测序技术尤其是甲基化芯片技术的发展与成本降低，使得大规模测序与检测成为可能。但本研究仍存在一定不足，如本研究属于横断面研究，缺乏时效性验证，结果可能存在一定偏倚；未对比海南地区少数民族人群与汉族人群的大肠癌筛查结果、病理特征；未分析其他基因甲基化的筛查结果等，故后期需将上述不足作为重点，进一步展开研究。