男性不育患者Y染色体微缺失的临床研究进展*

兰贵斌 余 飞 黄承乐 冯国钢

广西百色市人民医院检验科 533000

男性不育症是由于男性的各种生理因素引起的夫妻未采取任何避孕措施进行正常性生活>1年未能使女方怀孕,近年随着社会工作压力的增加及不良生活习惯的形成,男性不育症的发病率呈逐年升高趋势,根据相关流行病学调查显示,男性人群中有10%～15%的男性不育发生率,另外各种不孕不育症患者中,由男方因素导致的不育比例也约占一半[1]。因此,男性不育症的发生对有生育需求的患者及家庭产生严重的负面影响,并对患者的身心健康有不良影响[2]。目前,对于男性不育症的研究已成为临床研究关注的重点方向,经临床研究确证的男性不育发生原因有多种,精索静脉曲张、精索梗阻、隐睾症、性腺功能异常、感染性疾病、免疫性疾病等均为男性不育的常见原因,另外由染色体异常、基因突变导致的遗传缺陷是男性不育发生的重要原因,占所有男性不育患者的30%～40%[3]。

Y染色体微缺失是引起男性不育的一项重要遗传因素,Y染色体上有多达220个基因,其中Y染色体长臂上存在着与精子发生相关的基因,即为无精子症因子(Azoospermia factor, AZF),在进一步的研究中将这种AZF定位于Y染色体长臂(Yg11),将这种基因片段的缺陷称为Y染色体微缺失[4]。然而由于个体间遗传信息的差异性,Y染色体基因编码区也不是完全相同,不育症患者的Y染色体微缺失基因分布、表型、频率、缺失机制等也有差异性,这也成为目前临床对于男性不育Y染色体微缺失研究的主要方向[5]。为此,本文在查阅大量国内外相关文献报道的基础上,对男性不育Y染色体微缺失的研究现状、进展进行归纳分析,并从Y染色体微缺失基因分布、表型、发生率、Y染色体微缺失的机制研究、Y染色体微缺失与男性不育等进行综述,为揭示男性不育症患者的发病机制、诊断、治疗提供参考性建议。

1 Y染色体微缺失基因分布、发生率、表型

1.1 Y染色体微缺失基因分布 Y染色体在结构上有一个近端丝粒结构,以此丝粒为界将Y染色体分为长臂和断臂两部分,根据细胞遗传学的研究通常将Y染色体分为7个大区和43个亚区,而Y染色体微缺失主要定位在长臂(Yq11)位置,进一步对Y染色体微缺失位置的划分,AZF区在Y染色体长臂上由近至远分为3个不同的亚区段,分别是位于Yq11.21位点的AZFa,位于Yq11.23位点的AZFb、AZFc,其中AZFb的远端与AZFc的近端会出现部分重叠现象[6]。

AZFa是位于Yq近端的区域5内,其大小为1～3Mb,通过基因型的分析该区域能够识别的基因包括：DBY、DFFRY、FTY、UTY、TB4Y、TB10Y等。AZFb具体位置在Yq缺失区间的5～6近端,大小也为1～3个Mb,目前研究发现该区域能够识别5个基因包括CDY、eIF-1A、RBM、SMCY、XKRY。AZFc主要位于异染质的邻近区段,大小为1～4Mb,目前已经识别的基因BPY2、CDY、DAZ、PRY、RBM和TTY2等[7]。

1.2 Y染色体微缺失发生率 根据国内外相关研究报道[8],Y染色体上AZF缺失发生率为10%～55%,造成此区间范围的原因是AZF缺失受到人种、地域、环境、生活习惯等因素的影响。在具体的缺失类型中,微缺失发生率最高的是在AZFc区,能够占到总微缺失的60%左右,而AZFa、AZFb区域的缺失呈现少见的特点,AZFb缺失发生率为16%～30%,AZFa区域缺失发生的概率最低,据相关统计一般在1%～10%。另外还有极少比例的AZFd区域的缺失,占1%～5%[9]。

造成各基因型微缺失发生范围的差异性主要的原因包括以下几个方面[10]：(1)各临床报道纳入的研究对象存在的差异性,纳入的患者不育的原因可能是无精子症、弱精症、精子正常等不同的人群,而不同的症状也预示着患者病因的差异性,由此也表现出缺失发生率的不同;(2)患者在年龄、种族、职业、生活方式等方面有所不同,都会使得染色体微缺失基因型发生率的不同;(3)各报道中的试验研究方法不同,具体的如STS标记位置的选取差异性也会使得在微缺失基因型发生率方面的差异性体现。

1.3 Y染色体微缺失基因型与表型 AZFc区域缺失在总微缺失中占据绝大部分,进一步对其表型分析认为AZFc区域的缺失也存在表型多样化的特点,从轻度少精子症到无精子症,约有75%的缺失患者仅有Sertoli细胞,即病理表现为Sertoli细胞综合征(SCOS)Ⅰ型,而25%患者表型为无精子症或少精子症[11]。相关研究也揭示了AZFc表型众多的原因是患者的Y染色体的多个基因参与调控表达精子生成过程[12]。AZFb区域的表型主要与无精子或严重少精子有一定的关联性,通常其病理表现为精子生成受阻且停滞在在精母细胞阶段。AZFa区域缺失发生率最低,缺失患者主要表型与精子计数从无到正常但伴精子形态异常,病理检查表现为SCOS Ⅱ型相关[13]。

目前,关于Y染色体微缺失基因型与表型的研究虽然有很大的进展,但关于基因型与表型的关系尚未完全明确。首先,在现有的研究中仍然缺失睾丸活检的规范化实施方案及组织病理学的分类标准[14]。其次,男性不育患者随着病情的进展其病理学分型也有改变,如患者的生精子细胞的减少会随着时间的进展而加重。虽然各项报道间有一定的差异性,但总体上微缺失基因型与表型还是存在一定的趋势,表现为微缺失大部分发生在无精子及少精子患者中,且无精子患者的Y染色体微缺失的发生率大于少精子者,另外在精索静脉曲张、隐睾症等患者中也发现了Y染色体的微缺失现象[15]。

2 Y染色体微缺失的机制研究

对于Y染色体微缺失的机制研究是不育症研究的热点方向,现已明确的是Y染色体微缺失除小部分是遗传因素控制外,绝大多数是后天的再生现象,但导致染色体微缺失的原因及机制过程尚不清楚。一般认为是患者的睾丸来源的精子细胞起源时减数分裂出现差错导致,较少可见的是在受精卵起始阶段引起,由此可阻止胎儿精原细胞的合成。Y染色体微缺失发生率较高的原因也表明了患者对遗传物质的缺失是高度敏感的,但关于其缺失的机制研究仍然处于推测阶段[16]。

首先,机体的X和Y染色体之间以及Y 染色体本身出现的不平衡姐妹染色单体在遗传过程中的互换,以及患者Y染色体同源或相似的重复序列之间出现的异常重组情况。在患者细胞减数分裂时的Y 染色体的基因型分布对于异常的X、Y染色体互换转移是异常敏感的,而这种异常敏感特性会导致Y染色体微缺失的发生[17]。其次,Y染色体的微缺失与Y染色体自身不稳定性有关,Y染色体本身存在的高频重复序列在精子形成和胚胎发育的有丝分裂期间,Y染色体重复序列出现交叉互换,特别是在高度重复异染质Yq12、Yq11区域内,易出现微缺失,因此也可解释为什么主要微缺失区域在AZFa、AZFb、AZFc。再者,存在AZF微缺失的患者,其Y染色体序列通过测序分析,与正常人的Y染色体相比更易于发生缺失[18]。一项对Y 染色体常染色质区的3.5Mb段的基因测序表明,在最易出现微缺失的AZFc 区域,由于存在的大量重复扩增子序列,容易导致此区域的序列发生结构变异。扩增子相当于AZFc区多拷贝的大的 DNA 序列,其大小常为115～678kb,这些紧密排列的扩增子形成了人类基因组中空前复杂的遗传学结构,这些扩增子包含生精所需的基因片段,会导致患者Y染色体序列变异并出现Y染色体微缺失,最终导致不同程度的生精障碍及不育的发生[19]。

目前,随着研究的进展和深入,临床已经发现了多个AZF区域缺失的候选基因,最佳的一个候选基因DAZ基因位点,以DAZ基因位点以及其他位点基因所编码蛋白在生精细胞周期的调控和减数分裂过程中发挥重要作用,而这些基因位点的缺失会造成不同程度的生精障碍[20]。

3 Y染色体微缺失与男性不育

男性Y染色体具有遗传动力,并且由于高比例的节段重复序列的存在而易于发生显著性的变异,节段重复形成了在Y染色体各基因位点出现的各种缺失和重复的基础。大量的相关文献报道显示,Y染色体微缺失能够参与精子的发生过程,并能影响男性患者睾丸的发育状态,从而导致患者出现无精症或少精症[21]。也有研究表明,Y染色体长臂基因座含有大量的在睾丸中的转录基因,并且在精子发展中有明确的作用,这些区域的丧失会导致男性患者的不育[22]。

随着相关研究的深入,对于Y染色体长臂三个易出现微缺失的AZFa、AZFb、AZFc基因位点与男性不育关系研究也有了进一步的认识。AZFa区域编码的两个重要基因位点包括DFFRY、USP9Y,主要涉及RNA的代谢和转录过程,在睾丸组织中有表达。临床观察显示,轻度少精表型的病人仍然保留着转录的USP9Y基因但缺失DFFRY基因,这也反映了这两个基因有结合的需要以避免同时缺失所引起的SCOS发生[23]。既往的研究表明,在Y染色体微缺失中,AZFa最为少见,占整个Y染色体微缺失的1%～10%,但AZFa缺失患者的病情程度最为严重,大多数AZFa患者表现为SCOS,伴有睾丸体积缩小及无精症。AZFb区域包含的基因位点最重要的是RBM,而RMB基因可进一步细分为RBMY1～RBMY6,其中RBMY1在男性患者的睾丸内有特异性表达,且主要存在于生殖细胞发育的早期,包括精原细胞、初级精母细胞的细线期晚期和精母细胞,对粗线期中期和其随后的分化阶段以及单倍体的精子细胞中,研究表明RBMY1基因对精子发生初期过程有重要的调控作用,当患者缺失RBMY1时会导致患者在精子发生初期即不能进行[24]。AZFb基因全部缺失的患者表现为生精阻滞,生精过程停留在精母细胞或精子细胞阶段形成早期,临床表现为SCOS、无精症、少精症等具体类型的不育。AZFc区域缺失最为常见,该区域临近异染质区域,其调控的最重要基因是DAZ,但该区域出现微缺失时,临床表现为多样化[25]。

4 Y染色体微缺失检测

对于Y染色体微缺失的检测,常规染色体核型分析不易发现缺失Y染色体的微缺失区域,现阶段临床主要检测方法为序列标签位点(STS)的PCR扩增技术检测,以获取Y染色体的AZF微缺失区域信息。STS是一段已知核苷酸序列的DNA片段,能后反映染色体的不同序列组合,在检测Y染色体微缺失过程中通过以STS设计不同的引物序列,对AZFa、AZFb、AZFc等三个主要区域进行筛查,在每个计划筛查的区域以2～3个STS位点进行PCR扩增[26]。目前研究中,STS的数目还存在很大的差异性,在检测时采用多少个STS还存在一定的争议,无统一的标准,尽管Y染色体的AZF缺失的检测包括多个STS,但AZF缺失个体总会发生某些热点的缺失,故有必要提出一个简便快速的筛查原则以满足临床检测的需要。

在采用通过STS标记的PCR扩增技术检测Y染色体微缺失区域时,也应注意以下几点内容[27]：(1)采用单拷贝或局限于Y染色体小区域的PCR-STS是最有效的,而重复拷贝或跨越Y染色体长臂和短臂的全区域性标记在检测中难以获得满意的信息。(2)在一些男性不育患者中,一些标记的染色体信息会呈现自然丢失,造成检测结果的偏差,这往往与研究对象的选取、样本的采集等有关。(3)在一般男性不育患者的Y染色体中,多个、不连续的区域性缺失是较为少见的,在检测过程中遇到此类情况时应密切注意标记序列的顺序和PCR反应的可靠性。(4)在进一步确证任何可疑的重要Y染色体微缺失区域时,合适的对照和高质量的模板DNA序列是检测过程中所必备的条件。

5 小结与展望

近年来我国男性不育症发病率呈现逐年升高的趋势,有着庞大的男性不育症人群,既往的临床对于男性不育症发病机制的研究也取得了一定的进展,初步揭示了Y染色体微缺失导致患者遗传物质结构和数目的异常,都可能造成男性的生育障碍。Y染色体的AZF区域的缺失被证实与无精症、少精症和SCOS等发生有密切关联。因此,通过对Y染色体AZF区域微缺失的检测已发展成为诊断遗传性男性不育的重要技术手段,对于男性不育症患者的Y染色体微缺失筛查逐步受到临床的重视。随着研究的深入,对于男性不育患者Y染色体微缺失研究还存以下方向需要深入探讨,如进一步明确Y染色体微缺失基因型与表型的关系,为临床的诊断和治疗提供依据。其次,对Y染色体AZF基因缺失是否存在种族、环境、年龄等因素的影响也应进一步探讨阐明。另外,目前的研究主要集中在微缺失特征及基因的发现,对Y染色体基因编码的蛋白质则知之甚少,在RNA代谢和加工过程及生殖细胞的分化机制方面并未深入涉猎。再者,规范和统一临床检测的标准尚未完全建立,多项研究间的差异性并不能有效地对比分析。这些方向都是今后此类研究中亟待解决的内容,相信随着对Y染色体部分缺失区域性研究的不断深入,能为我国男性不育患者的基因诊断及临床治疗提供更理想的理论和科学依据。