人巨细胞病毒、年龄与免疫衰老之间的渊源*

宋雅琴 韦爱萍 彭 薇 周秀英 谢政军

1 遵义医科大学第五附属(珠海)医院血液内科,广东省珠海市 519100; 2 遵义医科大学珠海校区

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)是疱疹病毒科β亚科中的成员,也是感染人体最久远的病毒,具有230～240kbp的线性双链DNA基因组[1],在人群中普遍感染,感染率在60%～90%[2]。HCMV感染机体进入宿主细胞,便以潜伏状态长期留存于宿主体内,不表现出任何临床症状[3],之后可能发生间断、不定期的复制激活。自Pawelec等[4]对1995—2005这10年间大量无严重基础疾病的瑞典老年人群的免疫情况开展了大规模调查研究,发现老年人群中HCMV感染会导致免疫衰老的加重及巨细胞病毒病发病率的上升,从而提示HCMV潜伏感染可能会加速机体免疫衰老过程,人们便展开了对HCMV潜伏感染状态下引起免疫衰老背后原因的探究,其中多种因素交错相互影响。众所周知,机体免疫衰老与年龄高度相关,那么,HCMV、年龄在机体免疫衰老过程中扮演着什么角色和作用,以及HCMV感染后机体免疫衰老的演进过程如何,尚未完全明了,本文对近十余年的相关研究总结如下。

1 HCMV潜伏感染宿主细胞对免疫系统的影响

HCMV有能力诱导活动性感染和潜伏性感染,从而在原发感染后的人类宿主中建立终身持久性。在活动性感染中,HCMV复制过程经历即刻早期(IE)、早期(E)和晚期(L)阶段[5]。最关键的病毒活动性基因产物是病毒IE蛋白,它控制着随后的病毒基因表达和病毒复制。因此,这些主要的IE基因产物本质上决定了HCMV的感染状态：HCMV的静态(IE基因被抑制)或再激活(IE基因被表达)均与IE基因的表达状态相关。潜伏性感染是HCMV感染最重要的特征,其潜伏期病毒的存在方式是以静态为主,病毒基因组存在于染色体外质粒,多数情况下无法检测到传染性病毒载量的变化,但在特定的刺激因素作用后可重新被激活,引起病毒复制和载量增加,产生新的感染性病毒颗粒,这种再感染在宿主体内可能多次发生,形成一种慢性持续的炎症反应,最终引起机体众多组织和器官的严重损害和功能障碍。

HCMV通常在特定的细胞建立病毒潜伏期,主要累及CD34+造血祖细胞和髓系细胞。虽然原发性HCMV感染会引起广泛的先天和固有免疫反应,但是为了逃避宿主的抗病毒反应,HCMV开发了不同的免疫逃避策略,以改变宿主在活动性感染和潜伏感染期间的免疫识别。尤其是HCMV限制了最主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)Ⅰ类和Ⅱ类分子抗原呈递作用,使病毒能够在受感染的个体中存活、传播和持续存在。在具有免疫能力的个体中,原发性和终生持续的HCMV感染通常仍然是亚临床的,并受到宿主免疫系统的良好控制。

在原发感染的早期阶段,适应性免疫的主体是HCMV特异性CD4+T细胞,该亚群中的Th1细胞通过产生细胞因子IFN-γ和TNF-α对HCMV作免疫应答。在初始HCMV特异性CD4+T细胞反应的1周后,出现增殖且可以在血液中检测到高水平的HCMV特异性CD8+T细胞,该亚群细胞在之后的感染期内一直保持存在,以防止HCMV重新激活和保护宿主免受再次感染。此外,HCMV的体液反应也有助于控制病毒载量和防止人类的原发性感染。在原发感染后,B细胞在HCMV特异性CD4+T细胞的帮助下被抗原激活,主要是Th2细胞,导致产生一些HCMV蛋白特异性抗体。这些HCMV特异性抗体可以通过中和细胞外病毒子来阻止病毒颗粒的播散,这一方式对于保护胎儿免受先天性HCMV感染尤为重要。

2 HCMV感染致免疫衰老

2.1 HCMV、年龄、免疫衰老如影相随 持续的HCMV感染需要宿主免疫系统的持续控制,而宿主免疫系统本身会随着年龄的增长而改变[6]。报告显示,老年人群被感染者HCMV的发病率和死亡率明显要高于青年人,其重要原因之一就是免疫衰老。衰老的特点是在细胞和分子水平上都有明显的免疫重塑[7]。免疫衰老的始因在于随着年龄增大导致的胸腺退化,从而导致机体的免疫系统对病原体的反应能力逐渐弱化。HCMV长期潜伏感染被认为是人类免疫衰老的驱动因素之一[8]。调查还证实,HCMV持续性潜伏感染与老年人的总生存率下降和免疫风险表型(Immunological risk phenotypes,IRP)相互联系,IRP是一组评价机体免疫功能水平的重要指标,可以预测老年人2年死亡率。此外,老年人的抗HCMV IgG滴度与对病毒感染的抗体反应较低有关[9]。然而,仍然缺乏直接证据表明HCMV感染是否以及如何与免疫衰老有关。

2.2 HCMV感染状态下免疫衰老相关的免疫细胞变化 NK细胞是淋巴因子活化杀伤细胞(Lymphokine activated killer cells,LAK)的前体细胞,是机体在固有免疫应答过程中的关键免疫细胞,并在对HCMV的免疫监视中起到了关键作用。在HCMV感染者中NK细胞杀伤靶细胞的能力也随着年龄的增长而降低,表现为NK细胞功能的衰减,体现为IL-2诱导的 NK细胞分泌 IFN-γ减少,HCMV感染致死率与老年人 NK功能下降呈正相关。在小鼠试验研究中可推断出鼠巨细胞病毒(Mouse cytomegaloviru,MCMV)潜伏感染后,NK细胞在免疫系统中发挥着抗MCMV感染的免疫反应,NK细胞功能缺陷的小鼠趋向于患更严重的MCMV感染,亦有相关研究报告称,NK细胞功能缺陷的患者更易于发展成巨细胞病毒病。

B细胞主要参与体液免疫应答、疫苗接种产生特异性高亲和力抗体。免疫衰老会影响B细胞质量、数量以及使受体多样性降低,从而导致抗体数量减少,降低机体对病毒感染和疫苗接种的反应性,并加速自身对反应性抗体的形成。在与年龄相关的B细胞数量变化中,在小鼠的实验证据表明衰老会减少初始B细胞和血浆细胞的数量,以CD27+记忆B细胞的数量变化为主。由于随着年龄增长,不成熟B淋巴细胞向外周淋巴器官归巢缺陷,使B细胞对抗原的特异性识别功能逐渐下降,也会导致初始 B细胞数量下降,同时外周淋巴器官记忆B细胞的数量增加,而这种疲乏的记忆B细胞功能也是减弱的,而且对外来侵袭的病毒缺乏免疫应答能力。此外,与年龄相关的慢性巨细胞病毒感染可导致B细胞功能的改变。Wang等人[10]检查了在年轻人和老年人中编码免疫球蛋白重链的基因组库,以确定衰老和HCMV感染对B细胞亚群的影响,发现年龄并不影响变量、多样性或连接段的使用;然而,年龄段中较长互补决定区域3段(CDR3)的选择缺失表明,不同年龄组使用的耐受机制之间存在与年龄相关的差异,从而推测B细胞的免疫衰老可能与HCMV感染及其感染时限有关[11]。

HCMV长期潜伏感染宿主同时在慢性炎症刺激下会导致HCMV特异性T细胞克隆的大量扩增,主要免疫特征为CD8+CD27-CD28-的记忆性T细胞,随着年龄的增长特别是在老年人中,这被认为破坏了机体对其他病原体的免疫力,加速了免疫衰老。同时出现初始T细胞数量逐渐减少,TCR多样性减少,Treg、Th17、TFH亚群数量的增多。这些T细胞的变化会连锁引起以上B细胞、NK细胞功能的变化。

老年人的HCMV感染与免疫衰老有一定的相关性,并可能会影响宿主免疫力和加重衰老过程。然而,亦有人认为HCMV在免疫衰老过程中的病因作用仍存在相当大的不确定性。不能排除HCMV可能改善CD8+T细胞的多功能,从而有利于宿主免疫系统,至少在年轻健康个体中是这样。此外,目前还不清楚HCMV的再激活在老年人中是否比年轻人更频繁。因此,HCMV特异性CD8+T细胞随时间的延展是否真的有害仍不清楚。累积的功能失调的记忆T细胞在多大程度上会导致免疫衰老,以及这些细胞对其他免疫成分,如NK细胞、B细胞和T细胞有多大危害,这一点还有待观察。最后,宿主免疫系统可能在衰老期间无效地控制潜在的HCMV再激活,从而扩展病毒特异性T细胞克隆并进一步增强免疫衰老特性[12]。因此,在未来关于HCMV与免疫衰老的研究中,必须考虑到HCMV感染状态和HCMV控制状况。

3 HCMV致免疫衰老的T细胞亚群改变特征

3.1 随年龄增长HCMV感染人群中初始、记忆T 细胞等T细胞亚群数量变化及功能下降 细胞免疫功能减退逐步演进为免疫衰老是HCMV感染人群主要的免疫学变化,在老年人群中更甚。细胞免疫的变化以T细胞组成变化(初始与记忆T细胞亚群)为主,表现为CD3+T细胞、CD4+的初始T细胞数量的减少,记忆T细胞增加,这一状况随着年龄增加会更加明显。老年人HCMV感染者中CD27、CD28、CD122(IL-2R)、CD127(IL-7R)在CD4+或CD8+的记忆性T细胞亚群上表达水平均有下降,并同时伴有血浆中IL-2水平下降。

与随着年龄的增长免疫受损相比,记忆T细胞的比例在早期会增加,在整个成年期保持稳定,但在大约65岁后开始出现衰老变化。青少年时期产生的记忆T细胞可以很好地保存并在数十年内维持强大的保护作用,而老年时期产生的T细胞记忆反应受到严重损害。IL-7是维持T细胞平衡的关键因子,虽然衰老不会改变IL-7的水平,但通常会减少初始T细胞的数量,增加衰老T细胞的数量[13]。

3.2 随年龄增长HCMV感染人群中CD8+CD28-T细胞聚集性增加 免疫衰老的另一个特征是 CD8+CD28-T细胞的聚集,这些 CD8+CD28-T细胞的端粒较短,功能衰退,提示细胞处于终末分化阶段,同时这群细胞能够抵御TCR交联和细胞凋亡 ,使这群细胞有克隆聚集的能力,它们的聚集机制可能是对衰老个体初始 CD8+T细胞输出减少的代偿效应,机体试图通过这些细胞控制潜在的病毒感染,填充有效的T细胞空间。然而,该T细胞亚群的单克隆聚集竞争性抑制了新抗原入侵诱导的 TCR基因重排,当这些克隆聚集达到机体的极限水平后,T细胞对抗新感染的免疫保护能力就开始发生随年龄的增长下降。在衰老的进程中,CD4+和 CD8+T细胞的表型变化不大,而有复制衰老特征的CD8+T细胞的变化则更为明显,慢性病毒感染或机体衰老均可导致 CD8+T细胞的 CD28表达缺陷,而 CD4+T细胞的表现相对较轻,因此,老年个体的单克隆扩增 CD8+CD28-细胞的大量聚集是免疫衰老的重要特征之一。

3.3 随年龄增长HCMV感染人群中Th17、Treg、TFH细胞数量的变化 鉴于细胞因子是T细胞介导的免疫反应的关键调控分子,人们已经注意到,与衰老相关的T细胞缺陷可能起源于细胞因子产生的改变。特别是,细胞因子图谱的变化表明,年龄较大的T细胞主要显示出Th2样的表型[14]。Th17细胞保护宿主免受细胞外病原体的侵害,并与人类自身免疫性疾病和慢性炎症性疾病的发展有关[15]。在HCMV感染者中Th17和Treg的比例似乎随着年龄的增加而增加,Schmitt等人[16]认为,这一比例的变化可以解释自身免疫性疾病频率增加和对老年人感染反应减弱的原因。特别是老年人Th17细胞与Treg细胞的比例随年龄依赖性增加,可能会引发支持炎症细胞基底水平的改变,并导致自身免疫性疾病和对感染的免疫反应下降。TFH细胞在B细胞的免疫形成和抗体产生过程中发挥重要作用,TFH在高龄HCMV感染者中的数量会下降。

4 HCMV感染致免疫衰老的关键分子生物学事件

4.1 TCR多样性减少的背后分子变化 随增龄性变化,TCR多样性减少。在增龄和HCMV慢性炎症对免疫系统的共同作用下,宿主对新病原体和异型细胞的识别能力以及抵抗病原体的能力逐渐下降,感染性疾病和肿瘤性疾病发生率增加[17]。衰老的T细胞发生明显变化,降低了TCR的表达,导致人类CD4+T细胞中与年龄相关的TCR诱导基因的表达发生改变[18]。使用高通量Illumina测序平台分析显示,老年期TCR多样性明显减少。研究表明到40岁时,初始T细胞和TCR-β多样性的数量开始出现减少[19]。

4.2 T细胞端粒缩短及背后的分子变化 衰老期间免疫记忆的逐渐丧失与T细胞增殖能力降低和端粒缩短有关。端粒是位于真核生物染色体3'末端的DNA重复序列,能组成特殊 DNA-蛋白质结构。端粒缩短可诱导DNA损伤反应,如果DNA损伤没有修复,那么会导致细胞死亡(凋亡)或复制性衰老。由于染色体末端 DNA聚合酶的缺陷,每次外周血单个核细胞分化都会导致约 50．100bp端粒DNA的缺失,在HCMV慢性病毒感染期间,这种缺失有可能增加,端粒缺失可引起染色体的不稳定和末端融合,启动 p53控制的 DNA损伤修复序列,进一步加快凋亡的发生。老年HCMV感染者CD4+、CD8+T细胞的端粒较青年人短,端粒过短的后果是CD8+T细胞的复制衰老过早诱导,从中可以发现,人类记忆性T细胞端粒缩短的速率并不相同,HCMV特异性T细胞分化程度更高,对细胞衰老可能更加敏感,这些功能缺陷型 HCMV特异性T细胞可以进行自我调节如胞体变大,这样可以延缓 HCMV 感染[20]。综上所述,HCMV感染会导致更快的端粒缩短和免疫衰老。

4.3 表观遗传学变化及免疫衰老 还有大量证据表明,表观遗传变化在自然和病理免疫老化以及HCMV感染疾病中起着至关重要的作用。表观遗传学是指在DNA序列没有改变的前提下,通过DNA甲基化、组蛋白修饰和RNA转录相关而发生的基因表达可遗传变化,其引起的染色质结构变化是衰老过程的特征,导致衰老细胞功能障碍。据报道,从鲑鱼、牛、大鼠和老鼠到人类的许多不同生物组织的总体DNA甲基化水平会随着年龄的增长而下降,研究已经证实,年龄相关的甲基化变化取决于特定的白细胞种群和T细胞亚群[21-22]。在各种免疫细胞群中,T细胞亚群可能受到衰老过程的影响最大[22-23]。一项研究报告了与年龄相关的高甲基化位点,主要位于沉默基因的CpG岛。然而,研究者也观察到干扰素、CCL5、CCL7、CD27和其他T细胞功能基因的甲基化变化与基因表达之间有很强的相关性,且表观遗传调控在IL-2和IFN-γ的免疫应答和年龄相关差异基因表达中起着突出的作用。此外,考虑到HCMV在衰老过程中宿主免疫功能中的关键作用,进一步了解潜在的HCMV感染对跨调节元件表观遗传特征的影响可能为克服免疫缺陷提供一条新的途径。

5 小结

HCMV长期潜伏性感染是免疫衰老的始动环节。在反复的HCMV抗原暴露情况下,机体的NK细胞、B细胞、T细胞等主要免疫效应细胞功能下降以至最终衰竭。这一免疫衰老现象随年龄增长及感染时限的延长会逐步加重,表现为这些免疫效应细胞数量及亚群的变化,中间还有细胞因子网络的变化在起重要作用,但其中的先后关系及关键作用环节仍不清楚。以上提示年龄与免疫衰老只是表象上的相关,近年来随着分子免疫学、分子生物学和分子遗传学等新技术的应用,HCMV分子学机制以及免疫衰老的细胞分子学基础研究上取得了较大的进展,发现TCR表达水平的变化、T细胞端粒酶的缩短、共刺激因子、T细胞CD28表达水平、DNA甲基化、组蛋白修饰及关键信号的RNA转录水平的异常等环节可能是免疫衰老的主要原因。而这些关键分子事件的变化与HCMV的感染状态及感染时限息息相关,同步探索和阐明HCMV慢性感染后机体免疫系统的改变和免疫衰老的部分分子学机制,或者证实是 HCMV诱导免疫衰老还是HCMV仅仅是一个伴随相关性病原体,其致免疫衰老的主要原因仍然需要大量实验证据,以及合适的动物模型印证,以此找到免疫衰老的真正核心风险因子。从而从整体上增强老年人群的免疫能力,延缓免疫衰老,降低巨细胞病毒病发病率和死亡率,从细胞免疫角度提供解决的方向。