CAR-T新型联用策略治疗实体瘤研究进展

李梦媛，蒋小猛，孙沁怡，郭 薇*

（1中国药科大学 生命科学与技术学院，南京 210009；2南京医科大学逸夫医院消化内科，南京 211112）

CAR-T 疗法已在个性化肿瘤治疗中取得突破性进展，并且在血液系统恶性肿瘤的治疗中显示出优异的治疗效果，因此被认为是最有前景的肿瘤治疗方式之一。目前全球已有9 款CAR-T 细胞治疗产品上市，其中6 款靶向CD19，3 款靶向BCMA，这些靶点主要针对的适应证有急性白血病、B细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤等[1]。尽管CAR-T 治疗血液肿瘤取得了巨大进展，但其在治疗实体瘤中仍然存在诸多挑战，例如：T 淋巴细胞在肿瘤组织中浸润效果差、CAR-T 在致密的实体瘤中转运困难、特异性抗原稀缺及免疫逃逸发生、肿瘤免疫微环境（tumor microenvironment，TME）中的不利因素导致CAR-T 细胞作用受限等[2]。研究者针对这些问题已经开发了多种CAR-T 改造策略，如：设计细胞因子分泌型CAR-T以增强T细胞的持久性，设计多靶点CAR 分子防止抗原免疫逃逸发生、设计靶向基质细胞的CAR 分子以去除TME 中的抑制因素、优化给药策略来提高CAR-T 细胞递送效率[3]，但是仅仅单用CAR-T 的研究进程缓慢。随着多种新型肿瘤免疫治疗方法和纳米材料技术的发展，利用不同治疗方法和技术手段的优势可以有效解决CART 存在的弊端从而显著提升实体瘤的治疗效果，所以开发CAR-T 新型联用策略对实体瘤的治疗意义重大。本文讨论了CAR-T 细胞治疗实体瘤现存的挑战，针对这些问题总结了CAR-T 联用其他肿瘤治疗方法：抗体药物、溶瘤病毒、肿瘤疫苗、纳米材料应用于实体瘤治疗的研究进展，旨在帮助相关研究人员从多角度了解CAR-T 的研发策略，为开发新的CAR-T 联合用药策略提供思路，从而推动CAR-T药物在实体瘤临床应用的快速发展。

1 CAR-T治疗实体瘤面临的挑战

1.1 CAR-T浸润效果差、转运困难

血液肿瘤和实体瘤的不同在于血液肿瘤不会形成组织结构，但是实体瘤具有特殊的组织病理学特征，主要表现为：血管组织丰富、血管壁间较宽、结构完整性差、淋巴回流缺失以及大分子药物的选择性外渗和保留，这一现象被称为高通透性和滞留效应（enhanced permeability and retention effect，EPR），是影响CAR-T 细胞浸润实体瘤部位的重要原因[4]。

T 细胞的转运则涉及到T 细胞和内皮细胞之间的相互作用，在其迁移的过程中，诸多因素如：趋化因子-趋化因子受体不匹配、细胞黏附分子下调以及异常脉管系统的存在都有可能导致肿瘤特异性T细胞归巢失败[5]。

1.2 免疫抑制微环境

TME 主要由免疫细胞、基质细胞以及其他非细胞成分组成，TME 中的成分与肿瘤细胞相互作用从而促进疾病进展以及耐药性的发生，而且这些相互作用使得TME 产生乏氧、低pH、免疫抑制性细胞数量增多、抑制受体上调、肿瘤来源细胞因子分泌等现象，这些变化会导致CAR-T 治疗效果不佳[6]。所以通过去除免疫抑制因素，来提升CAR-T治疗效果有重要意义。

1.3 特异性抗原稀缺及肿瘤免疫逃逸

实体瘤治疗效果不佳的部分原因是缺乏高表达的肿瘤特异性抗原（tumor specific antigen，TSA）及肿瘤免疫逃逸机制的发生。TSA 仅在肿瘤组织中表达，因此是最理想的靶点，但是其发现、筛选过程较为困难，所以目前大部分的CAR 靶点是肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA），但是使用TAA 可能会影响CAR-T 细胞对肿瘤细胞的识别能力，从而导致CAR-T 的治疗效果降低[7]。再者，肿瘤细胞可以通过免疫逃逸机制来躲避免疫系统的攻击，使得CAR-T 不能有效识别肿瘤细胞，从而加速病情的恶化。目前已有研究者为解决靶点发现困难及肿瘤免疫逃逸的问题设计多靶点CAR-T、优化抗原亲和力、设计细胞因子分泌型CAR-T，同时也有创新型肿瘤免疫疗法或者递送方法来提升药效，并且取得了优异的效果。

2 新型联用策略改善实体瘤治疗

2.1 抗体药物与CAR-T疗法联用

抗体药物发挥作用有多种途径，主要包括细胞毒性作用、调节细胞激活能力、 抑制血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factors, VEGFs）等[8]，故肿瘤治疗抗体可分为细胞毒性抗体药物、免疫检查点抑制剂、血管生成抑制剂等。由于TME 中免疫细胞比例、抗原表达情况以及信号通路的某些变化会导致CAR-T 疗法效果不佳，通过联用抗体药物可以改善TME 中的不利条件，且CAR-T 和抗体可以互相弥补治疗中的不足，使得患者的治疗响应率大幅提升。

2.1.1 细胞毒性抗体药物 目前FDA 获批的大

部分肿瘤治疗抗体药物需要依赖细胞毒性作用发挥药效。细胞毒性作用主要通过抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）、补体依赖性细胞毒性作用（complement-dependent cytotoxicity，CDC）和抗体依赖性细胞吞噬作用（antibody-dependent cell-mediated phagocytosis，ADCP）清除肿瘤细胞[9]。目前已有研究者设计CAR 分子联合细胞毒性抗体药物提升实体瘤的体外杀伤效果，例如Caratelli 等[10]设计了表达Human Fc gamma RIIA（CD32A）的CAR-T 细胞，CD32A 分子通常存在于巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞（ dendritic cells ，DCs）等细胞中，其与IgG具有一定亲和力，二者结合后可促进ADCC作用发生。在体外研究中，CD32A-CAR-T 细胞可同西妥昔单抗或帕尼单抗结合靶向杀伤EGFR+乳腺癌细胞且具有较高的杀伤相关细胞因子分泌水平。

2.1.2 免疫检查点抑制剂 免疫检查点是一类免疫抑制性的分子，其可以调控T 细胞的活化状态，促进免疫耐受发生。常见的免疫检查点主要有PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG-3 等，均是实体瘤中广泛分布的免疫检查点，对T细胞的免疫抑制状态有重要作用[11]，CAR-T在治疗实体瘤患者时经常会因为TME 中免疫检查点的上调导致T 细胞的活化状态受到抑制、致使T 细胞发生耗竭，所以CAR-T疗法可以联用免疫检查点抑制剂来解决这一问题。TME 中肿瘤细胞高表达配体蛋白PD-L1、PDL2，同时T 细胞表面PD-1 表达上调，使得PD-1/PDL1通路持续激活，T细胞发生耗竭从而导致药效持续时间短，故PD-1/PD-L1 抑制剂可以使得CAR-T细胞恢复活化状态[12]。在一项治疗恶性胸膜间皮瘤的临床Ⅰ期实验中，研究者在输注靶向间皮素的CAR-T 后给予PD-1 抑制剂帕博利珠单抗，发现联合用药组在12周仍可在外周血中检测到CAR-T细胞和持续的IgG 反应[13]。除了直接抑制免疫检查点外，还可以抑制与免疫检查点上调相关的其他免疫细胞。Yamaguchi 等[14]发现TME 中M2 巨噬细胞会抑制CAR-T 细胞活性，这与M2 诱导CAR-T高表达PD-L1相关，使用PD-L1抑制剂阿替利珠单抗或者阿维鲁单抗可导致M2 死亡，从而提高CAR-T细胞的抗肿瘤活性。

2.1.3 血管生成抑制剂 实体瘤的生长和转移需要新生血管，其中有多种生长因子参与肿瘤血管生成，其中最重要的是VEGFs 家族。VEGFs 通过刺激内皮细胞的增殖、增加血管通透性、在骨髓中募集血管前体细胞来促进肿瘤血管生成，肿瘤内大量无规则的新生血管导致抗肿瘤药物的低效递送[15]。且VEGFs对T细胞有免疫抑制作用，故可以使用VEGF/VEGFR 抑制性抗体改善T 细胞功能、阻止血管生成来增强抗肿瘤免疫力。Bocca等[16]研究了靶向GD2 的CAR-T 联合阿瓦斯汀对神经母细胞瘤小鼠模型的治疗效果。阿瓦斯汀不但可以抑制血管生成，还可以修复和重编程肿瘤脉管系统，使得TME血管正常化，从而提升CAR-T细胞在肿瘤部位浸润能力及杀伤效果。

2.2 溶瘤病毒与CAR-T疗法联用

溶瘤病毒（oncolytic virus，OV）是一种可以特异性复制，具有嗜瘤性并且保证正常组织不受到破坏的病毒。OV 可以通过多种作用机制发挥抗肿瘤作用，即：直接裂解肿瘤、释放TAA、释放细胞内损伤相关分子模式及病原体相关分子模式来激活抗肿瘤免疫应答，或者释放细胞因子及趋化因子来逆转TME 中的不利条件起到间接抗肿瘤作用[17]。根据OV 发挥作用的方式，其优势可以分为3 个方面：(1) OV 对癌细胞的直接裂解作用导致肿瘤溶解和TAA 的释放，诱导抗肿瘤适应性反应，从而防止抗原丢失引起的肿瘤逃逸；(2) OV可以破坏实体瘤屏障以促进T 细胞浸润；(3) OV 可以破坏TME 中的免疫抑制成分，增强CAR-T 细胞的持久性和抗肿瘤活性[18]。所以利用OV 的多种优势，可以提高CAR-T 对TAA 或TSA 的靶向能力、增强T细胞在实体瘤部位的浸润效果及活化作用从而更好地治疗实体瘤。

OV 联合CAR-T 疗法的设计思路有多种，如设计细胞因子分泌型OV、靶向趋化因子受体/配体的OV、负载免疫检查点抑制剂的OV、加装免疫共刺激分子的OV 等。设计IL-2、IL-15、TNF-α 等细胞因子分泌型OV 可以大幅提升CAR-T 细胞活性[19]。例如Watanabe 等[20]构建了负载TNF-α 和IL-2 的溶瘤腺病毒OAd-TNFα-IL2，实验结果显示联合用药组的小鼠肿瘤消退显著。靶向趋化因子受体/配体则可以去除TME 中的抑制因素来提升免疫细胞浸润能力。Wang等[21]利用溶瘤腺病毒负载了趋化因子CXCL11，OAd-CXCL11 可对TME 进行重编程，使得免疫抑制性细胞的比例下降。表达免疫检查点抑制剂的OV 可以解决TME 中T 细胞活化功能受到抑制的问题，设计表达双特异性T细胞接合剂（bispecific T-cell engager，BiTE）的OV 可以增强T细胞的靶向能力，同时通过旁观者效应将肿瘤免疫细胞富集在肿瘤组织周围发挥效应功能[22]。例如Porter 等[23]设计了可分泌BiTE、PD-L1 抑制剂的腺病毒CAdTrio，在HER-2 及CD44v6 双阳性头颈部鳞状细胞癌小鼠模型中验证了联用效果。结果表明与CAR-T 单独用药组相比，该联用策略的小鼠生存期显著延长、肿瘤杀伤相关细胞因子分泌量增加，T 细胞具有更持久的抗肿瘤效应。加装免疫共刺激分子如CD40、4-1BB 可增强免疫细胞的局部激活扩增，例如Wenthe 等[24]设计了编码CD40L 和4-1BBL 的溶瘤病毒LOAd703，其除了可以激活抗原呈递细胞（antigen-presenting cells，APCs）和T 细胞，还能促进免疫细胞归巢所必需的趋化因子如CXCL10、CCL17 等的分泌，从而增强CAR-T细胞的迁移能力。

2.3 肿瘤疫苗与CAR-T疗法联用

在过去的50 年中，治疗性肿瘤疫苗已经进行了大量的临床前及临床研究，其主要通过激活人体免疫系统、发挥特异性抗肿瘤反应来起到治疗作用，是一种很有发展前景的抗肿瘤免疫治疗手段。肿瘤疫苗的作用机制是将抗原递呈给树突状细胞（dendritic cells，DC），再将活化信号传递给T细胞，经过T细胞的活化、增殖和运输后，高效清除肿瘤[25]。所以CAR-T 疗法联合肿瘤疫苗可以增强T 细胞在实体瘤部位的免疫反应性。肿瘤疫苗发挥作用的关键在于抗原递送的能力，根据抗原递送载体不同，肿瘤疫苗可分为细胞疫苗、核酸疫苗和多肽疫苗[26]。

细胞疫苗的发展以DC 疫苗为主，DC 可以通过多种机制摄取TAA 及TSA、刺激T淋巴细胞增殖产生抗肿瘤反应。DC 细胞的抗原递呈能力、共刺激分子或共抑制分子的表达情况，决定了免疫系统的激活或者抑制[27]。Wu 等[28]设计了Eps8-DCs疫苗，将其与CD19-CAR-T 细胞联合用于治疗复发性白血病患者，结果表明Eps8-DCs 可以增强CART细胞的增殖能力并且促进免疫功能的发挥。

核酸疫苗的作用方式是将编码蛋白基因的序列直接导入宿主体内，使其表达抗原蛋白，从而产生免疫反应。联用核酸疫苗和CAR-T 疗法可以使淋巴结中的APCs 表达CAR-T 靶向的目标抗原，从而促进CAR-T细胞在体内大量扩增，解决T细胞耗竭的问题。例如Reinhard 等[29]设计了靶向CLDN6的CAR-T 细胞和mRNA 疫苗的联合治疗方法，该研究将含有CLDN6序列的mRNA 核酸分子递送到全身淋巴系统中使APCs 递呈CLDN6 来促进T 细胞的增殖。

多肽疫苗是通过化学合成技术制备的肿瘤特异性肽，在体内可以激活对多肽疫苗特异性反应的T 细胞，从而增强T 细胞的扩增能力和持久性[30]。Ma 等[31]设计了一种多肽疫苗，在注射到体内后，该疫苗可以被转运到淋巴结并表达在APCs的表面进而激活CAR-T 细胞。根据小鼠体内药效实验结果,未输注疫苗的CAR-T治疗组给药两周后在血液中基本检测不到CAR-T 细胞，而经过疫苗免疫的治疗组血液中有大量CAR-T 细胞存在，约为全部T细胞的65%。

2.4 纳米药物与CAR-T疗法联用

纳米药物是指尺寸为1 ～ 1 000 nm 的纳米载体或药物，其可以选择性聚集在发病区域并且发挥药效，同时防止药物在正常组织发生聚集现象[32]。纳米药物的治疗方式主要分为3 种：（1）靶向肿瘤细胞引起免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD）；（2）靶向TME，消除或者重编程免疫抑制细胞，或者诱导TAA 于APCs 上，增强免疫细胞的增殖能力和肿瘤浸润效果；（3）靶向外周免疫系统，如淋巴结及脾脏[33]。利用纳米药物的优势，可以更高效地发挥CAR-T细胞抗肿瘤作用。

2.4.1 诱导免疫原性细胞死亡 纳米药物可以促进肿瘤细胞ICD的发生，通过增加免疫效应细胞的浸润、将免疫抑制性TME 转化为免疫原性TME来提高抗肿瘤效果。通常化疗、放疗、光热疗法等治疗手段可诱发ICD[34]。其中光热疗法和CAR-T联合策略在实体瘤治疗中展现出良好的发展前景。例如Chen 等[35]把光热制剂ICG 包裹在纳米颗粒PLGA 内注入黑色素瘤小鼠体内，将肿瘤局部升温至40 ℃后，再将CAR-T 细胞输注到小鼠体内。该策略可以破坏肿瘤细胞外的基质，扩张血管促进血液流动，使得CAR-T 细胞富集在肿瘤周围，同时高温可使得肿瘤部位引起炎性反应，促进多种细胞因子分泌。

2.4.2 改善免疫抑制微环境 利用纳米材料的特点，可将需要调控的基因递送到肿瘤细胞或免疫细胞从而改善TME 不利环境条件来提升CAR-T细胞治疗效果。目前针对TME 设计纳米材料的策略聚焦在包装趋化因子受体、免疫检查点抑制剂、促炎细胞因子、抗炎细胞因子抑制剂等。

纳米材料包装趋化因子受体、免疫检查点抑制剂联合CAR-T 治疗可提升T 细胞转运、浸润及效应持续性。Miao 等[36]将靶向PD-L1 和CXCL12的DNA 分子融合封装在纳米颗粒中，在胰腺癌小鼠模型中联合治疗组T 细胞的运输和浸润能力明显提高。将促炎细胞因子如：IL-2、IFN-γ等递送到TME 中可以增强肿瘤免疫治疗[37]；也可以递送抗炎细胞因子抑制剂，例如递送转化生长因子（transforming growth factor-beta，TGF-β）分子抑制剂来恢复T 细胞功能。Jiang 等[38]开发了纳米材料β-环糊精-PEI 用于封装TGF-β 抑制剂和表达IL-12 的腺病毒载体，其可以激活TME 中的CD4+和CD8+T细胞。

2.4.3 解决靶抗原缺乏及肿瘤免疫逃逸问题解决TSA 缺乏问题有两种方式：一种是修饰肿瘤细胞，使其表达更高丰度的抗原，从而招募T 细胞发挥作用；另一种是增加APCs 和T 细胞之间的反应性，提高抗原递呈效果。第一种策略可以促进CAR-T细胞的增殖、提高T细胞在肿瘤组织中的浸润能力。例如Sun 等[39]设计了负载靶抗原的纳米颗粒F-AgNPs，其可以特异性修饰肿瘤细胞，通过细胞间脂质转移到实体瘤深层组织中，使得CART 细胞产生免疫应答。另一种策略是靶向APCs 与CAR-T 细胞之间形成的免疫突触（immunological synapse，IS）。Zang 等[40]研究了神经节苷脂纳米颗粒GM3-NPs，它可精准定位IS，引发T 细胞免疫应答。

除候选靶抗原缺乏问题外，肿瘤免疫逃逸的发生也需要解决，利用纳米材料可以增加不同靶抗原的识别能力。Alhallak等[41]开发了一种纳米脂质体nanoBiTEs，其一端可以靶向T 细胞的CD3 分子，另一端可以靶向多种肿瘤抗原，防止肿瘤免疫逃逸。

2.4.4 提高T细胞增殖能力 纳米材料用于增强T 细胞增殖能力主要聚焦在增加抗原刺激程度和新型水凝胶的发展上[42]。

增强抗原刺激的策略是提高靶抗原在全身淋巴系统及肿瘤部位的表达量，从而刺激CAR-T 细胞增殖。例如Reinhard 等[29]将编码CLDN6 抗原的mRNA递送到脾脏、淋巴结以及骨髓的APCs上，启动Toll 样受体依赖性Ⅰ型干扰素驱动的免疫刺激程序，使得T细胞增殖活化。

水凝胶可封装CAR-T 细胞、细胞因子、免疫检查点抑制剂等，可控制地将细胞释出，并且可以截留细胞因子和免疫检查点抑制剂使得细胞不断受到刺激增殖，同时防止细胞耗竭发生。Grosskopf等[43]开发了聚合物-纳米颗粒（polymer-nanoparticle，PNP）水凝胶，将IL-15 和CAR-T 细胞共同封装于PNP 中。IL-15 使得CAR-T 细胞不断增殖和活化，同时PNP 对IL-15 的截留作用可防止细胞因子风暴发生。Hu 等[44]开发的水凝胶除了封装T 细胞及细胞因子外还可以封装PD-L1 抑制剂防止T 细胞发生耗竭。

2.4.5 靶向外周免疫系统 靶向外周免疫系统旨在增强次级淋巴器官中的抗原递呈能力和促进CTL 的产生，提高外周免疫细胞群的抗肿瘤能力[45]。利用纳米疫苗有效穿透组织屏障，对抗原高效递送、可控释放和呈递的特点可以提升CAR-T疗效[46]。未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤寡脱氧核苷酸（CpG oligodeoxynucleotides，CpG-ODN）是一种常用佐剂[47]，Chen 等[48]使用纳米颗粒Au-DENPs封装CpG-ODN 递送至骨髓来源DCs，给药后第八天，在脾脏和肿瘤中检测到大量CD4+T 细胞和CD8+T 细胞，证明该策略可触发适应性免疫应答。在淋巴系统中递送抗原mRNA 也可以使T 细胞发挥效应，例如Chen 等[49]将编码卵清蛋白的mRNA通过脂质纳米颗粒递送到淋巴系统增加了CD8+T细胞的反应性。

3 总结及展望

CAR-T 疗法虽然已在血液肿瘤的治疗中取得了突破性进展，但在实体瘤的治疗中困难重重，仍有多个问题需要解决，如：TME 中的抑制性信号发生、实体瘤抗原靶点匮乏、肿瘤免疫逃逸现象、T细胞浸润效果差、易发生脱靶现象等[50]。针对这些问题，单独使用CAR-T 治疗无论是在临床前还是临床研究中都很难取得令人满意的治疗效果，故联合其他肿瘤免疫治疗方法对于实体瘤治疗发展有重大意义。抗体药物凭借不同的作用机制改善CAR-T 单独给药效果不佳的问题；OV 可以将“冷肿瘤”转化为“热肿瘤”，促进肿瘤细胞的直接溶解；肿瘤疫苗通过将抗原递呈给DCs，使得T 细胞增殖能力大幅提升；纳米载体递送药物/基因可清除免疫抑制细胞、防止免疫抑制信号的产生，或者通过外周免疫系统促进T细胞增殖、增强杀伤肿瘤能力。这些肿瘤免疫疗法优势各不相同，可以从不同方面弥补CAR-T 治疗的不足，所以迫切需要研究并阐明不同实体瘤需要攻克的难关及治疗效果差的根本影响因素，从而采用最优的联合方案进行治疗。目前本研究团队已经针对CAR-T 在实体瘤中的浸润效果差的问题，利用抗体药物能够发挥ADCC作用的特质，开发了同抗体具有结合能力的CAR-T，在抗体靶向肿瘤的作用下，引导T 细胞浸润实体瘤部位，促进抗体及CAR-T 细胞药效的发挥。本团队已经取得了优异的体内外结果，可初步判断具有转化为临床应用的潜力。除了联用抗体药物，本团队认为联用纳米材料也具有良好的发展前景，纳米材料卓越的递送能力使得药物更易到达致密的实体瘤部位，凭借这一特点可以递送小分子药物、细胞因子、核酸分子等来提升CAR-T 疗效。其他组合策略也值得科研工作者研究，在实现药物临床前有效的基础上，完成用药安全性评价、临床联合治疗效果评估等工作，以造福更多实体瘤患者。