自发气调包装对芥蓝采后叶绿素降解及品质保持的影响

王 玲，戴凡炜，吴继军，叶明强，陈飞平，戚英伟，罗 政，陈敏惠，陈于陇

(广东省农业科学院 蚕业与农产品加工研究所/农业农村部功能食品重点实验室/广东省农产品加工重点实验室， 广东 广州 510610)

芥蓝(Brassicaoleraceavar. Alboglabra)属于十字花科(Brassicaceae)芸薹属(Brassica)植物，富含丰富的维生素C、类胡萝卜素、酚类化合物、葡萄糖苷等活性成分，在抗氧化及抗癌等方面作用显著，是一种具有丰富营养和药用价值的蔬菜[1]。鲜食是芥蓝主要的消费方式，但芥蓝叶片表面积大、含水量高，由于呼吸代谢、蒸腾作用导致其货架期短、损耗高[2]。在常温下贮藏2～3 d芥蓝即出现叶片黄化、萎蔫、薹茎空心等现象，严重影响其商业价值和食用价值。研究发现，利用氯吡苯脲(CPPU)、1-甲基环丙烯(1-MCP)，或复合保鲜剂通过熏蒸及浸泡等处理能有效减缓芥蓝采后品质劣变，此外真空预冷、低温贮藏等物理保鲜技术也是延长芥蓝贮藏保鲜期的重要方法[3-7]。但是，熏蒸、浸泡处理需要精准地控制浓度和时间，增加了生产环节及成本，而真空预冷、低温贮藏都需要结合相应的设备才能实施。因此，采用绿色安全、方便操作的保鲜技术减缓叶片黄化对芥蓝采后品质保持具有重要意义。

自发气调贮藏利用果蔬自身的呼吸作用以及包装袋薄膜的透气、透湿功能，通过微环境改变，抑制呼吸代谢和减少乙烯的生物合成，达到保持果蔬品质的目的[8]。已有研究表明：自发气调包装可有效保持桑叶菜采后品质[9]，减缓荔枝失水褐变[10]等，对延缓果蔬衰老具有良好的控制作用。自发气调贮藏既可以在常温货架期发挥对果蔬的保鲜作用，同时结合低温贮藏可达到更优的保鲜贮藏效果。研究发现对于富含叶绿素的果蔬，高CO2条件能有效抑制叶绿素的分解，达到保绿效果，维持果蔬品质[11-12]。叶绿素的降解是叶菜类蔬菜叶片黄化的直接原因，目前人们对叶绿素降解机制已进行了深入的研究，叶绿素降解途径受到多种关键酶及编码基因调控，脱镁叶绿酸a加氧酶(pheide a oxygenase，PAO)途径是主要的生化途径[13]。但目前，通过自发气调包装控制芥蓝采后叶片黄化的贮藏保鲜研究较少，对芥蓝采后叶片叶绿素降解途径的研究尚需进一步完善。本研究采用不同的自发气调袋包装芥蓝，通过测定袋内环境气体组分及叶绿素代谢相关酶活性和基因表达水平变化，筛选可有效延缓采后芥蓝叶绿素降解及品质变化的自发气调包装，以期为自发气调包装在芥蓝采后保鲜中的应用提供一定的理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

白花芥蓝，2021年4月19日采购自广州市郊东升农场。低密度聚乙烯(LDPE)微孔保鲜袋，厚度为0.01 mm，佳能公司。自发气调袋1(modified atmosphere packaging 1，MAP1)、自发气调袋2(modified atmosphere packaging 2，MAP2)，广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所改良的低密度聚乙烯配方，委托广东宝德利新材料科技股份有限公司生产。2种改性气调袋性能分别为：1)MAP1，厚度为0.02 mm、O2透过率为11 643 cm3/(m2·d)、CO2透过率为17 460.5 cm3/(m2·d)、透湿性为62.586 g/(m2·d)；2)MAP2，厚度为0.03 mm、O2透过率为5 625 cm3/(m2·d)、CO2透过率为8 437.5 cm3/(m2·d)、透湿性为17.812 g/(m2·d)。无水乙醇、丙酮、考马斯亮蓝、氢氧化钠、盐酸，分析纯，上海源叶生物有限公司；液氮，佛山市普雷克斯公司；脱镁叶绿酸a加氧酶(pheide a oxygenase，PAO)、植物脱镁叶绿素酶(pheophytin pheophorbide hydrolyase，PPH)活性检测试剂盒，上海酶联生物科技有限公司；RNA提取试剂盒，北京天根生物科技有限公司；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒，湖南艾科瑞生物工程有限公司。

1.2 仪器与设备

CTHI- 150B型恒温恒湿箱，STIK施都凯仪器设备(上海)有限公司；UV1800型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；Direct- Q3型纯水仪，德国Merck Millipore公司；Checkmate 9900型顶空气体分析仪，丹麦 PBI 公司；CFX ConnectTM型实时荧光定量PCR(qRT-PCR)仪器，美国Bio-Rad公司；UltraScan VIS型色差仪，美国Hunter Lab公司。

1.3 实验方法

1.3.1样品处理

芥蓝采收后立即运至实验室，在冷库4 ℃进行预冷，随后选取无机械损伤，长度、茎粗细均匀的新鲜芥蓝进行包装，分别用市售LDPE微孔保鲜袋(对照)、改性LDPE气调袋(MAP1、MAP2)进行包装，袋子大小390 mm×300 mm，每袋(300 ±1)g，热封机密封，贮藏于15 ℃恒温箱，在0、3、6、9 d取样，每个处理每次随机、均匀取3袋，进行相关指标的测定。

1.3.2气体组分变化测定

用顶空气体分析仪测定包装袋内O2与CO2含量，每个包装袋上、下各选取3个部位分别贴上密封橡胶垫片，探头针缓慢插入包装袋内，进行测定，每组处理重复测定3袋。

1.3.3芥蓝颜色测定

将待测芥蓝叶(从上往下数展开叶第4片)正面放在色度仪的检测孔上运行程序，测定叶片的L*值、a*值、b*值。每袋芥蓝至少随机测10次色度值并取平均值，每组处理重复3袋。

1.3.4商品率测定

芥蓝叶片绿色，无黄叶，记为0级，商品率为100%；芥蓝叶片出现轻微黄化，黄叶面积约为25%，记为1级，商品率为75%；芥蓝黄叶面积约为50%，记为2级，商品率为50%；芥蓝大部分叶片黄化，75%≥黄叶面积≥50%，记为3级，商品率为25%；芥蓝衰老，叶片黄化，黄叶面积≥75%，记为4级，商品率为0。总和贮藏过程中芥蓝叶片黄化衰老变化，商品率按式(1)计算。

商品率=∑[(每级芥蓝的数量×

所在级数的商品率)/调查总数]×100%。

(1)

1.3.5叶绿素含量测定

参考Zhang等[14]的方法，在黑暗条件下使用体积分数80%丙酮浸提叶片叶绿素，利用分光光度计测定663、645 nm处吸光度，按式(2)计算叶绿素质量浓度(mg/L)，再按式(3)计算组织中叶绿素质量比，单位为mg·g-1。

ρ(叶绿素)=20.29×A645+8.05×A663；

(2)

(3)

式(3)中，V为提取液体积，mL；N为稀释倍数；m为样品鲜重，g。

1.3.6可溶性蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝法进行测定，单位为mg·g-1。

1.3.7失重率测定

失重率计算见式(4)。

(4)

式(4)中，m1为贮藏前芥蓝质量，g；m2为贮藏后芥蓝质量，g。

1.3.8维生素C含量测定

采用2，4二硝基苯肼比色法测定维生素C的含量，单位为mg·g-1。

1.3.9叶绿素降解酶酶活测定

CLH活性参考Han等[15]的方法测定。PPH、PAO活性采用试剂盒进行测定，酶活单位为U·g-1。

1.3.10qRT-PCR分析

叶片组织RNA提取使用植物总RNA提取试剂盒进行，琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量。qRT-PCR分析参考反转录试剂盒说明书，将1 μg RNA反转录合成得到cDNA，以逆转录得到的cDNA为反应模板，参照艾瑞科生物公司的SYBR Green Pro Taq HS预混型qPCR反应试剂盒说明书进行qRT- PCR扩增分析，内参基因beta-actin及目的基因PaO、PPH、CLH1、RCCR(红色叶绿素代谢产物还原酶，red chl catabolite reductase)、CHLI(镁螯合酶Ⅰ亚基，magnesium-chelatase Ⅰ subunit)、CHLD(镁螯合酶D 亚基，magnesium-chelatase D subunit)、CS(叶绿素合成酶，chlorophyll synthase)、NYC(叶绿素b还原酶，non-yellow coloring)基因引物序列参考文献[16]，委托上海生工生物公司合成。采用Livak和Schmittgen(2001)的2-ΔΔCT公式计算基因相对表达量[17]。

1.4 数据处理

采用Excel 2010软件进行数据统计处理，SPSS软件对数据进行方差分析和相关性分析，并利用 Duncan多重性比较，进行差异显著性分析。数据表示为平均值±标准偏差，不同字母代表P<0.05水平上差异显著，P<0.01水平上差异极显著。

2 结果与分析

2.1 不同包装对芥蓝贮藏期品质变化规律的影响

2.1.1不同包装芥蓝贮藏期袋内气体组分变化

贮藏袋中的各组分气体的体积分数对果蔬的生理活动有重要影响。3组包装袋内的O2及CO2气体体积分数变化见图1。由图1(a)可知，在整个贮藏期间，CK组袋内O2体积分数无明显变化，维持在20%上下；而MAP1、MAP2 组O2体积分数极显著低于CK组(P<0.01)，O2体积分数在贮藏 3 d时明显下降，分别下降至3.13%、1.12%；在贮藏3～9 d时，MAP1组O2体积分数呈上升趋势，MAP2组O2体积分数趋于稳定，在贮藏9 d时MAP1组O2体积分数极显著高于MAP2组(P<0.01)。

由图1(b)可知，在整个贮藏期间，CK组内CO2体积分数呈不断上升的趋势，在贮藏9 d时，CO2体积分数积累至 1.33%；而MAP1、MAP2处理组明显不同于CK组，在贮藏 3 d时，MAP1、MAP2组CO2体积分数已分别迅速上升至4.33%、4.63%，并且在3～9 d时，CO2维持在一定的平衡状态，均极显著高于CK组(P<0.01)，未出现明显的变化趋势，但在贮藏9 d时，MAP2组较MAP1组维持了较高的CO2体积分数，差异极显著(P<0.01)。结果表明：MAP1与MAP2包装处理通过快速降低O2体积分数，积累CO2改变了袋内贮藏的微环境，且在贮藏 9 d时，MAP1与MAP2 组气体体积分数极显著不同(P<0.01)。

图1 不同包装袋中O2和CO2体积分数变化Fig.1 Changes of O2 and CO2 volume fractions at different packaging bags

2.1.2不同包装对芥蓝贮藏期外观品质及商品率的影响

不同包装对芥蓝贮藏期外观的影响如图2。3种包装对芥蓝贮藏期的外观品质保持有不同的影响。贮藏0 d时的芥蓝，薹茎粗壮多汁，叶片饱满、肥厚，并覆盖有厚厚的白色蜡粉，呈深蓝绿色，花球紧密，花蕾未开放。随着贮藏时间的延长，15 ℃下芥蓝叶片逐渐变黄，CK组贮藏3 d时整株叶片已发黄，花蕾开放，失去食用价值，商品率为51.25%；而MAP1、MAP2包装组在贮藏3 d时叶片呈现深绿色，叶片上的白色蜡粉减少，花蕾少部分开放，仍具有食用价值，商品率分别为95.83%、96.43%。在贮藏6 d时，3种包装的芥蓝已全部发黄，叶片有明显的失水现象，CK组黄叶最为严重，只有叶片局部呈现黄绿色，且花蕾开放后，掉落花朵，商品率为6.25%；MAP1、MAP2包装组芥蓝黄化略好于CK组，花蕾尚有部分未开放，但也失去食用价值，商品率分别为25.00%、36.10%。在贮藏9 d时，CK组叶片已呈现干、黄状，叶片全部黄化，花朵全部脱落，商品率为0；MAP1组叶片全部黄化，花蕾开放、部分脱落；MAP2组仍有叶片局部呈现黄绿色，尚有花蕾未开放，商品率分别为2.50%、5.00%。可见，MAP1、MAP2包装可减缓芥蓝叶黄化速率，延缓花蕾的开放，尤其是在贮藏前期(0～3 d)保持良好的外观品质。

2.1.3不同包装对芥蓝贮藏期叶绿素含量及颜色的影响

叶片黄化是评价芥蓝感官品质及可食性的主要因素，而叶绿素含量是影响叶片是否呈现绿色的主要原因之一，与黄化密切相关。不同包装下芥蓝叶绿素质量比及色度值变化见图3。由图3(a)可知，各包装处理的芥蓝叶绿素质量比均随着贮藏时间的增加呈现下降的趋势，其中CK组下降最快，贮藏3 d时下降了26.47%，其次是MAP1组下降了14.67%，MAP2组叶绿素质量比仅下降了4.74%，3组叶绿素质量比差异显著(P<0.05)；在贮藏9 d时，CK、MAP1、MAP2组叶绿素质量比分别为0.07、0.12、0.22 mg/g，各包装处理间差异极显著(P<0.01)。结果表明：MAP1与MAP2包装能够减缓叶绿素的下降，MAP2组较MAP1组能维持更高的叶绿素含量。

图3 不同包装下芥蓝叶绿素质量比及色度值变化Fig.3 Changes of chlorophyll mass ratio and chroma value in Chinese kale at different packaging bags

同时，通过色差仪测定叶片贮藏时期的L*值、a*值、b*值，也反映了不同包装处理组的芥蓝叶片在贮藏期间颜色的变化情况[图3(b)～(d)]。亮度L*值表示叶片颜色由明到暗的变化程度，由图3(b)可知，不同包装处理组的芥蓝L*值逐渐上升，表明随着贮藏时间的延长叶片表面的亮度增加。在贮藏0～6 d，CK组L*值上升速率高于其他2组，在贮藏9 d时无明显差异。由此可见，在15 ℃贮藏期间，芥蓝叶片明显由深绿色转变为黄绿色，增加了亮度，而MAP1与MAP2组能够抑制芥蓝叶片颜色变化。

a*值为红绿值，值越大表示绿色损失越多。由图 3(c)可知，不同包装处理组的芥蓝a*值呈现先下降后上升趋势，说明随着贮藏时间的延长叶片绿色呈现出先增加后逐渐变浅的过程。贮藏0～3 d，3组处理a*值下降，无明显差异；贮藏3～6 d，CK组a*值不断上升，显著高于2个气调袋包装组(P<0.05)，而2组气调袋包装处理在贮藏6 d后，a*值才逐渐上升；贮藏9 d时，CK组a*值最大，MAP1组次之，MAP2组a*值最小，各包装处理差异显著(P<0.05)。结果说明，在15 ℃贮藏3 d后，芥蓝叶片绿色明显变浅；而MAP1与MAP2包装延缓叶片转色，在贮藏后期MAP2包装较MAP1效果更好。

b*值代表蓝黄程度，值越大表示颜色越黄。由图3(d)可得，不同包装处理组的芥蓝b*值均呈现不断上升趋势，表明随着贮藏时间的延长叶片黄色增加。其中CK组的上升速率最快，气调包装处理在贮藏0～6 d减缓了叶片黄化速率，贮藏6 d时MAP1与MAP2包装b*值显著低于CK组(P<0.05)，2组气调包装b*值无明显差异，表明MAP1与MAP2包装可延缓芥蓝叶片黄化速率。

2.1.4不同包装对芥蓝贮藏期营养物质的影响

失水导致果蔬萎蔫，新鲜度下降，而包装处理是减少果蔬失水的重要手段之一。3组包装处理对芥蓝贮藏期失重率的影响如图4(a)。在整个贮藏期间，3组处理失重率不断上升。在贮藏3 d后，MAP1、MAP2组失重率开始低于CK组，并在贮藏9 d时，极显著低于CK组(P<0.01)，但MAP1、MAP2组失重率无明显差异。结果表明，MAP1与MAP2气调袋包装在贮藏后期可减缓芥蓝失水。

芥蓝富含丰富的维生素C，不同包装下芥蓝贮藏期维生素C质量比的变化如图 4(b)。在整个贮藏期间，3组包装处理维生素C质量比均不断下降，CK、MAP1、MAP2组在贮藏3 d后，维生素C质量比从64.30 mg/100 g分别下降了23.36%、6.50%、14.34%，3组处理中MAP1包装维持较高的维生素C质量比(60.12 mg/100 g)，极显著高于CK组(P<0.01)。但贮藏6～9 d，3组包装处理维生素C质量比差异不显著(P>0.05)。结果表明：MAP1与MAP2包装在贮藏前期(3 d)可延缓维生素C质量比的下降，MAP1与MAP2组间无明显差异。

可溶性蛋白与植物生理活动密切相关，也是果蔬贮藏品质的重要指标之一，贮藏期间芥蓝可溶性蛋白质量比的变化见图4(c)。由图4(c)可知，随着贮藏时间的延长，芥蓝可溶性蛋白质量比均呈下降趋势，CK组下降速率最快，其次为MAP2组，MAP1组维持了较高的可溶性蛋白质量比。MAP1组在贮藏3d时，可溶性蛋白质量比明显高于CK和MAP2组(P<0.05)，在6～9d时与MAP2组无差异，极显著高于CK组(P<0.01)。可见，MAP1与MAP2包装可有效抑制可溶性蛋白质量比的下降。

图4 不同包装下芥蓝营养物质质量比的变化Fig.4 Changes of nutrients mass ratio in Chinese kale at different packaging bags

2.2 不同包装对芥蓝贮藏期叶绿素降解的影响

2.2.1不同包装对芥蓝贮藏期叶绿素降解酶活性的影响

不同包装处理对芥蓝叶绿素降解相关酶活性的影响如图5。由图5(a)可知，不同包装芥蓝的CLH活性均随着贮藏时间延长不断下降。CK组CLH活性下降最快，在贮藏6 d时，CK组CLH活性极显著低于MAP1、MAP2组(P<0.01)；在贮藏3、9 d时，3组处理无明显差异(P>0.05)。在整个贮藏期MAP1、MAP2这2组CLH活性无差异(P>0.05)。可见，MAP1、MAP2包装相较于CK组在贮藏期更能保持较高的CLH活性，2组气调包装叶绿素降解明显受到抑制但CLH的活力反而提高，CLH可能并不是影响芥蓝叶绿素降解的关键酶，这与宋慕波等[18]的研究结果类似，CLH不是香蕉和大蕉叶绿素降解的关键酶。

由图5(b)可知，CK组的PPH活性在0～3 d先上升，3～6 d下降，6～9 d略有上升，贮藏3d时是酶活性高峰，极显著高于MAP1和MAP2组(P<0.01)。MAP1、MAP2组PPH活性变化明显不同于CK组，在0～3 d酶活性无明显变化；3～9 d酶活性迅速升高，随后下降，2组气调包装均在贮藏6 d时出现酶活性高峰，极显著高于对照组(P<0.01)。在贮藏9 d时，MAP1组包装保持较高的酶活性，CK组最低，3组处理间差异显著(P<0.05)。可见，MAP1、MAP2包装相较于CK组推迟了PPH活性高峰的出现，延缓了叶绿素降解；MAP2组比MAP1组PPH活性更低(P<0.05)，MAP2组较MAP1组对芥蓝叶片保绿效果更好。

由图5(c)可知，3组处理的PAO活性在贮藏 0～3 d均先下降，3～6 d逐渐上升；而6～9 d，CK组保持相对平衡状态，但MAP1、MAP2组酶活性仍不断上升。在贮藏6 d时，CK组的PAO活性极显著高于其他2组(P<0.01)，MAP1、MAP2组无显著差异(P>0.05)。贮藏9 d时，MAP2组PAO活性显著高于CK组(P<0.05)。结果表明：贮藏 3～9 d，PAO活性不断上升；贮藏6 d时，MAP1、MAP2包装抑制了PAO活性上升，减缓了叶绿素降解过程和叶片黄化速率，MAP1和MAP2组无明显差异。

图5 不同包装下芥蓝叶绿素降解酶活性的变化Fig.5 Changes of activities of chlorophyll degradation enzymes in Chinese kale at different packaging bags

2.2.2不同包装对芥蓝贮藏期叶绿素代谢相关基因表达的影响

为进一步探究气调包装对芥蓝黄化机制的影响，对贮藏期芥蓝叶绿素代谢相关基因表达量进行了分析，见图6。本研究分析了编码叶绿素合成代谢通路中镁螯合酶(magnesium-chelatase, CHL)和叶绿素合成酶(chlorophyll synthase，CS)两类重要调控酶基因的表达差异。CHL是研究最为广泛的一类ATP依赖的螯合酶，由I、D和H这3个亚基组成，是叶绿素合成途径中第一个定向的步骤[19-20]。qRT-PCR结果显示：镁螯合酶3个编码基因CHLI、CHLD、CHLH表达模式基本一致[图6(a)～(c)]。CK组的3个基因表达量均随着贮藏时间延长不断下降，在贮藏3 d时，3个基因表达量均高于MAP1组，显著低于MAP2组(P<0.05)，在贮藏6～9 d表达水平低于MAP1、MAP2组；MAP2组3个基因在贮藏3d出现表达峰，较CK和MAP1组显著上调(P<0.05)，且在贮藏9 d表达量也显著高于其他2组(P<0.05)。CS催化叶绿素酸酯a(chlide a)和叶绿素酸酯b(chlide b)分别生成叶绿素a和叶绿素b[21]。CS基因表达量变化如图6(d)，在整个贮藏期CK和MAP1组CS基因表达量差异不显著(P>0.05)，均低于MAP2组；且在贮藏3、9 d较MAP2组极显著下调(P<0.01)。结果表明：与CK和MAP1组相比，MAP2包装明显促进了叶绿素合成代谢通路中CHLI、CHLD、CHLH、CS基因表达，在贮藏3 d出现高表达峰，而CK组这4个基因表达量均不断下降。

叶绿素降解受组织内多种酶类代谢调控。CLH催化叶绿素水解生成脱植基叶绿素和植醇，曾被认为是叶绿素降解代谢的第一步[22]。研究结果显示[图6(e)]，相比于0 d，3组处理中CLH1在采后贮藏期基因表达量均极显著下降(P<0.01)；贮藏3 d时，CLH1在CK组的表达水平显著高于MAP1、MAP2组(P<0.05)，在MAP1组的表达水平显著高于MAP2组(P<0.05)；贮藏9 d时，MAP2组表达量显著高于其他2组(P<0.05)，CK组的最低。但CLH1表达与CLH活性变化不一致，可能是CLH受多基因编码导致，尚需进一步研究。PPH是叶绿素降解代谢的关键酶，去镁叶绿素a(phein a)在PPH作用下除去植基，最后生成脱镁叶绿酸a(pheide a)，而脱镁叶绿酸a转变为荧光代谢产物pFCCs主要依赖PAO和RCCR[23-24]。qRT-PCR结果显示：PPH基因在CK组的表达量随着贮藏时间延长先上调后下降，在贮藏6 d出现表达峰，在3 d和6 d表达量均高于MAP1和MAP2组；而MAP1和MAP2组均在贮藏9 d时表达量高于CK组，在整个贮藏期间，MAP1组在6 d时出现表达峰，MAP2组在9 d时出现表达峰[图6(f)]。PAO基因表达量变化如图6(g)，其表达模式类似于PPH，贮藏期CK组PAO表达量先上升后下降，且在贮藏6 d出现表达峰，显著高于2组气调袋包装(P<0.05)，整个贮藏期CK组PAO表达量均显著高于MAP1组，MAP1的PAO基因表达量在3 d和9 d显著低于MAP2。叶绿素b还原酶(non-yellow coloring，NYC)基因也具有类似的表达模式[图6(h)]，CK和MAP1组的NYC在贮藏6 d出现表达峰，MAP2组表达峰推迟出现在贮藏9 d。RCCR基因表达模式略有不同[图6(i)]，CK和MAP1组的RCCR基因表达量先下降后上升，在贮藏后期再下降，而MAP2组呈先上升后下降的表达趋势。在贮藏3 d时，MAP2组RCCR表达量上调，极显著高于其他2组(P<0.01)；但CK组在贮藏6 d出现表达峰，高于2组气调袋包装，贮藏9 d时3组表达量无明显差异。结果表明：气调袋MAP1和MAP2包装在贮藏前期(3、6 d)可抑制CLH1、PPH、PAO、NYC叶绿素降解酶基因的表达，推迟PPH、PAO、NYC基因表达峰的出现。

不同小写字母表示同一时间组间数据差异显著(P<0.05)。图6 不同包装下芥蓝叶绿素合成酶及降解酶基因表达量的变化Fig.6 Changes of gene expression of chlorophyll synthesis and chlorophyll degradation enzyme in Chinese kale at different packaging bags

3 讨 论

叶片褪绿转黄是采后绿叶蔬菜贮运和销售过程中品质劣变的主要问题之一。绿色环保的贮藏保鲜方法成为绿叶菜采后贮藏亟须研发的方式。本研究详细探索了自发气调包装对芥蓝贮藏期品质变化的影响。在室温15 ℃贮藏条件下，气调袋包装处理抑制了L*值、a*值、b*值的上升[图3(b)～(d)]，芥蓝叶片保持了较高的叶绿素含量[图3(a)]，其中MAP2气调包装效果最为显著(图2)。已有研究报道采后绿色蔬菜的气调贮藏对保鲜的作用，如气调包装延缓西蓝花乙烯释放，抑制呼吸强度，延缓叶绿素下降[25]。Huang等[11]研究发现菜心贮藏在体积分数5%O2和10%CO2的条件下可有效减缓叶片黄化。将梨果实贮藏在18 kPa或2.5 kPa O2、2 kPa CO2的气调环境下，可有效延缓梨果皮黄化[26]。在这些气调包装处理下贮藏期果蔬的生理代谢变化，可能与气体组成和果蔬生理活动的相互作用有密切关系。本研究中，芥蓝在MAP1、MAP2袋内O2含量极显著低于对照包装(P<0.01)，CO2快速积累，维持在一定平衡状态，最终形成低O2、高CO2的贮藏环境，减缓芥蓝叶片品质劣变。低氧环境可以有效降低果蔬新陈代谢，由于线粒体中电子传递链的末端氧化酶对氧气有很高的亲和力，但一般控制在体积分数2%～10%较为适宜，O2体积分数接近2%时，会引起组织的厌氧呼吸[27]。本研究使用的自发气调包装具有一定自发调节功能， MAP1、MAP2 的袋内O2始终维持在合适范围，可发挥良好的保鲜效果。MAP1和MAP2袋内的O2和CO2含量变化存在差异，对芥蓝失重率和维生素C、叶绿素、可溶性蛋白含量等产生不同的影响。因此，应针对不同的果蔬选择适宜的气调袋及包装方式，达到有效保鲜的目的。

芥蓝作为华南地区主要的绿色蔬菜之一，采后叶片衰老是影响其品质的主要因素。在叶片衰老黄化过程中叶绿素不断分解，原有的类胡萝卜素暴露出来而使叶片黄化，这是一个从老的组织回收营养的主动过程[22]。叶绿素的合成及降解是由一系列酶共同作用的生化反应过程，涉及的酶由多个相关基因编码[13]。本研究结果表明：芥蓝贮藏过程中叶绿素合成酶基因CHLI、CHLD、CHLH、CS不同程度地受到自发气调包装的调控表达[图6(a)～(d)]。CHL催化镁离子螯合到原卟啉IX中，形成镁原卟啉IX，是叶绿素合成的关键酶和重要调控酶[20, 28]。MAP2显著提高了芥蓝贮藏期CHLI、CHLD、CHLH基因表达量，相关性分析发现叶绿素含量变化与CHLD、CHLH的表达水平呈现显著相关性(P<0.05，相关系数分别为0.681与0.716)。CS催化叶绿素生物合成途径中的最终反应，并参与整个叶绿素生物合成途径的反馈控制，其活性降低会导致代谢通量下调[29]。研究结果表明：CS在CK组贮藏期表达量较低，变化不明显，MAP2包装增加了CS表达量。在芥蓝叶片黄化衰老过程中，叶绿素合成途径中相关酶基因表达不断下调，但自发气调包装提高了叶绿素酶合成基因的表达，可能对减缓叶绿素降解有一定的影响。因此，气调包装处理可通过影响芥蓝叶片叶绿素的合成代谢参与调节叶片衰老进程。

研究表明，叶片衰老过程中CLH以及PPH这2种叶绿素降解途径发挥着重要作用[30]。近年来，绿色蔬菜采后黄化衰老的叶绿素降解调节得到了广泛关注和研究。樊艳燕等[30]研究发现，CLH基因在青花菜贮藏期表达水平低，CLH可能主要参与青花菜初始衰老时叶绿素的降解，在随后的衰老中作用较小；马阳历等[31]研究发现BOSGR、BoPPH和BoRCCR参与西蓝花采后贮藏过程的叶绿素代谢，BoPPH是促进黄化的主要原因。叶绿素降解是一个多酶参与、多步骤的反应。叶绿素b先转化成叶绿素a，然后降解，NYC催化叶绿素b向7-羟甲基叶绿素a的转化[32]。本研究结果发现：NYC基因表达不断上调，自发气调包装抑制了NYC基因表达，推迟了表达峰，在减缓叶绿素降解过程中起重要作用[图6(h)]。相关性分析发现叶绿素含量与NYC基因表达呈显著负相关，相关系数-0.641(P<0.05)。叶绿素在由脱镁叶绿酸a转化成pFCC的过程中，PAO和RCCR起重要的作用，PAO是叶绿素降解途径中脱绿代谢的关键酶[33]。本研究结果表明：PAO基因表达在芥蓝贮藏过程中逐渐上调并保持较高水平，但气调包装MAP2显著降低了PAO基因上调表达[图6(g)]，相关性分析发现叶绿素含量与PAO基因表达呈显著负相关，相关系数-0.591(P<0.05)。RCCR基因在贮藏3～6 d时表达量上调随后下降[图6(i)]。类似的变化规律也有一定报道。Fukasawa等[34]的研究发现，花椰菜黄化过程中，对照组BoPaO、BoRCCR基因表达在贮藏前期明显上调，随后下降。同时，PPH活性及PPH基因表达量在芥蓝叶片黄化期均呈上升及高表达量趋势[图6(f)]，主要影响叶绿素降解过程。此外，通过叶绿素代谢酶活性及基因表达的相关性分析，自发气调包装提高了叶绿素合成途径CHLI、CHLD、CHLH、CS基因表达，抑制了叶绿素降解基因CLH1、PPH、PAO、RCCR、NYC的表达，同时，改变了不同贮藏时期芥蓝CLH、PPH、PAO酶活性变化速率，达到延缓叶片黄化衰老的作用。由于气调包装主要是通过改变袋内微环境的气体组成发挥保鲜作用，本研究中气调包装可能通过调节芥蓝所在环境的气体组分，调节了芥蓝的氧化衰老，从而进一步通过对叶绿素合成及降解代谢的调节，达到延缓芥蓝褪绿衰老的目的。

4 结 论

本研究分析了气调包装处理对采后芥蓝叶片黄化衰老的生理生化指标及叶绿素合成降解代谢的关键基因表达的调节。芥蓝采后易发生叶绿素降解，自发气调包装通过改变袋内贮藏的微环境，最终形成低O2和高CO2贮藏环境，减缓了生理代谢活动，降低了芥蓝贮藏过程中失重速率和维生素C、可溶性蛋白的损失，保持良好的贮藏品质。采后芥蓝贮藏过程中，自发气调包装袋如MAP2通过延迟PPH活性峰出现，降低PAO活性增加速率，增加叶绿素合成途径CHLI、CHLD、CHLH、CS基因表达，并在不同贮藏时期抑制CLH1、PPH、PAO、RCCR、NYC叶绿素降解基因的表达，延迟表达峰的出现，进而减缓叶绿素降解，延缓叶片黄化。此外，研究发现自发气调包装抑制芥蓝叶绿素降解，但CLH的活力反而提高，叶绿素酶可能不是芥蓝叶绿素降解的关键酶，但尚需进一步研究。因此，气调包装处理可能为芥蓝等绿色蔬菜的采后贮藏保鲜提供新的选择。研究结果旨为进一步探索绿色、环保、高效的绿叶蔬菜采后贮藏保鲜方法提供一定参考。