户太8号桃红葡萄酒贮藏期香气物质损失及添加剂护香效果分析

李文艳，徐雅强，王凌云，许引虎，倪学理，张永刚，马 娜，陶永胜，*

(1.西北农林科技大学 葡萄酒学院， 陕西 杨凌 712100；2.商洛市特色产业与休闲农业指导中心， 陕西 商洛 726000；3.安琪酵母股份有限公司， 湖北 宜昌 443000； 4.陕西甲邑酒庄有限公司， 陕西 三原 713800；5.陕西丹凤葡萄酒有限公司， 陕西 丹凤 726200)

我国葡萄总产量多年来居世界首位，葡萄栽培面积位列第二，但是绝大多数葡萄是鲜食葡萄，成熟期集中且不耐贮运，容易出现市场过剩问题，亟待进行深加工[1-3]。葡萄是适宜酿酒的水果，适度发展新鲜型葡萄酒产业，能够延伸鲜食葡萄产业，提高果农收益，促进一二三产业融合[4]。户太8号葡萄是陕西关中地区主栽的鲜食葡萄品种，其品质优良且抗逆性强，既可作鲜食，又可制汁或酿酒[5-8]。然而，户太8号葡萄的酿造实践显示，由于葡萄果实粒大、皮薄、籽少，花色苷等酚类物质在发酵过程中浸提有限，且葡萄酒中的挥发性物质的种类和含量也低于赤霞珠等酿酒葡萄所酿酒，因此，户太8号葡萄更适用于酿造起泡葡萄酒或桃红葡萄酒[5,9]。此外，户太8号葡萄酒贮藏期间香气损失较快，其货架期低于常用酿酒葡萄所酿的葡萄酒产品[10]。因此，研究户太8号等鲜食葡萄所酿酒的贮藏期护香工艺具有重要的产业发展技术支撑意义。

近些年来，国内外已有葡萄酒贮藏期使用添加剂处理护香应用的相关文献报道。例如，葡萄酒发酵或贮藏期间酵母自溶释放的甘露糖蛋白能够提高葡萄酒中酒石酸和蛋白质的稳定性，具有保护葡萄酒风味典型性的作用[11]，酵母葡聚糖对葡萄酒风味物质具有大分子的吸附作用，能够影响葡萄酒香气物质的挥发呈香效果[12-14]。此外，也有学者研究得出，谷胱甘肽可以减缓香气物质在葡萄酒陈酿期间的损失速度[15]，酚酸处理有助于葡萄酒香气的持久性[16]。但是，上述添加剂处理在鲜食葡萄所酿酒中的应用及护香效果尚不清楚，缺乏数据支撑。本工作研究户太8号桃红葡萄酒贮藏期的香气物质损失的变化规律，并在文献研究基础上，设计了几种添加剂处理应用于户太8号桃红葡萄酒，分析其对葡萄酒贮藏期香气的作用效果，希望为户太8号桃红葡萄酒的贮藏工艺优化提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 葡萄原料与酿酒菌株

户太8号葡萄：欧美杂交品种，2019年8月采自陕西省商洛市户太8号葡萄基地，含糖量175 g/L，总酸含量5.19 g/L(以酒石酸计)，卫生状况和成熟度良好。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，RV002型酵母活性干粉，安琪酵母股份有限公司。

1.2 仪器与设备

HW.SY21- KP8型智能恒温水浴锅，北京长风仪器仪表公司；ME203E型电子天平，上海梅特勒- 托利多仪器有限公司；DW- YL270型低温冰箱，中科美菱低温科技有限公司；GC/MS- QP2020型气相色谱- 质谱联用仪，日本岛津公司；DB- WAX型毛细管柱，美国安捷伦科技公司。

1.3 实验试剂

葡萄糖、亚硫酸水溶液(w=6%)，天津化学试剂公司；甘露糖蛋白MP60(mannoprotein)、葡聚糖(glucan)，安琪酵母股份有限公司；没食子酸(gallic acid)，质量分数≥99%，北京Sigma-Aldrich公司；还原型谷胱甘肽(L-glutathione)，质量分数≥99%，北京Biotopped公司。

标准品：乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸己酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、异丁醇、异戊醇、1-己醇、1-庚醇、1-辛醇、异丁酸、己酸、辛酸、癸酸、琥珀酸二乙酯、苯乙醇、苯乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯、里哪醇、α-萜品醇、香茅醇、1-己醇、(Z)-3-己烯-1-醇，北京Sigma-Aldrich公司。

1.4 实验方法

1.4.1葡萄酒酿造方法

采摘正常成熟的户太8号葡萄，除梗破碎后添加60 mg/L SO2(1 L葡萄汁中加入1 mL的w=6%的亚硫酸水溶液)，葡萄醪迅速入罐，约5 ℃温度条件下浸渍12 h，而后温度回升至20 ℃左右，按照质量分数0.2‰接种酿酒酵母启动发酵。酒精发酵温度控制在20～25 ℃，每天监测葡萄汁比重和温度，添加蔗糖调整最终酒度到(11.5%±0.5%)vol。待发酵液比重下降至1.020时分离葡萄皮渣，发酵液转入干净罐中继续发酵，温度控制在18～20 ℃，当比重降至0.997，测定还原糖的含量，确认其低于2.0 g/L时，将葡萄酒转入干净罐中，添加60 mg/L SO2终止发酵，10 ℃条件下满罐贮藏。

1.4.2添加剂处理方法

取满罐密封贮藏的户太8号桃红葡萄酒样品，分别添加300 mg/L葡聚糖(Pu组)[12]、250 mg/L没食子酸(Aci组)[16]、300 mg/L甘露糖蛋白(Man组)[17]和20 mg/L谷胱甘肽(Glu组)添加剂[18]，混合均匀，在室温条件下继续满罐密封贮藏。每隔45 d采样，进行香气成分的仪器分析，贮藏1年后，进行酒样香气成分的测定和香气特征的感官分析。每种添加剂处理设3次重复。

1.4.3香气成分分析方法

葡萄酒香气成分采用顶空固相微萃取结合气相色谱- 质谱联用方法(headspace solid phase micro-extraction combined with gas chromatography-mass spectrometry，HS- SPME- GC/MS)进行分析[19-20]。

顶空固相微萃取(HS- SPME)：萃取纤维为DVB/CAR/PDMS(膜厚50/30 μm，长2 cm)，配有57330- U型联动手柄。在20 mL顶空瓶中加入8 mL稀释4倍的葡萄酒样品和20 μL内标溶液(2-辛醇，40 μg/L)，再加入2.0 g NaCl。启动搅拌子，在40 ℃水浴中平衡15 min，然后插入萃取纤维，在40 ℃下吸附30 min后立即将萃取头进样至气相色谱进样口(230 ℃)解析5 min。

GC- MS条件：色谱柱为DB- WAX型毛细管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)。不分流进样，载气为高纯氮气，流速1.5 mL/min。柱升温程序：初始温度40 ℃，以3 ℃/min升高至130 ℃，再以4 ℃/min上升至250 ℃，并保持8 min，共运行60 min。进样口230 ℃，连接杆温度220 ℃，离子源温度200 ℃。质谱检测器为EI源，电子源电压70 eV，全扫描质谱范围m/z25～350 u，扫描频率0.2 s/次。

定性方法：查询NIST 2.0和Wiley谱库，并将化合物的保留时间和质谱与标准品比较进行定性分析，对于没有标准品的化合物采用质谱查询定性分析[20]。

定量方法：用内标- 标准曲线法定量，内标物为2-辛醇，用5点法绘制标准曲线，将化合物峰面积与内标物峰面积的比值带入其标准曲线计算可得定量结果，标准曲线见式(1)。对于没有标准品的化合物采用化学结构相似的标准曲线进行计算，见式(1)。

y=kx+b。

(1)

式(1)中，y为待测化合物在酒中的质量浓度，μg/L；x为标准品峰面积与2-辛醇峰面积的比值。

1.4.4香气特征的感官分析方法

香气特征的感官分析参考赵宇等[21]的方法。品评小组由经过系统闻香培训的葡萄酒专业的15名研究生组成。感官分析实验中，每个酒样重复2次，在黑色标准葡萄酒杯中倒入30 mL酒样，供试酒样进行随机编号和排序。每位成员在提供的葡萄酒标准香气特征表中选择3～5个特征词汇描述酒样香气，并用“5点标度法”(1～5表示香气特征强度)对香气特征进行评分，计算方法见式(2)。

(2)

式(2)中，MF为某一香气特征的最终量化强度值，%；F为品评小组对香气特征词汇的使用频率，%；I为强度平均值，%。

1.5 数据处理

采用单因素方差分析(ANOVA)进行试验数据的差异显著性分析，利用主成分分析(principal component analysis，PCA)研究不同处理对酒样香气物质的影响。数据处理使用SPSS 20.0软件进行，运用Origin Pro 2022软件绘制数据的变化趋势图。

2 结果与讨论

2.1 贮藏期的香气物质损失

不同品种葡萄果粒的大小和果皮的厚度不一样，发酵过程中葡萄原料里的香气前体物质经浸渍进入酒中的情况有很大差别[22]。本研究中，户太8号桃红葡萄酒贮藏1年后，香气物质定性定量分析结果见表1。由表1可知，户太8号桃红葡萄酒中共检出33种香气物质，包括酯类14种、醇类9种、脂肪酸4种、萜烯类4种、己(烯)醇类化合物2种。从含量上分析，户太8号葡萄酒香气物质总含量为166.5 mg/L，发酵香气成分占比较大，其中酯类和醇类化合物分别占总检出挥发性物质含量的32.1%和66.4%。研究结果与Song等[9]的研究结果一致，户太8号桃红葡萄酒中的香气物质及其种类低于常用酿酒葡萄所酿葡萄酒。

然而，气味活性值(OAV，质量浓度/阈值)的分析表明，乙酸乙酯、乙酸异戊酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、异戊醇、辛酸、苯乙醇和里哪醇的OAV大于1，而乙酸异丁酯、庚酸乙酯、癸酸乙酯、异丁醇、1-庚醇、1-辛醇、异丁酸、乳酸乙酯、苯乙酸乙酯、乙酸-2-苯乙酯和香茅醇的OAV为0.1～1，说明除了发酵香气成分之外，一些品种香气物质也对最终的户太8号葡萄酒香气有重要贡献。

户太8号桃红葡萄酒贮藏期间主要的香气物质的变化趋势见图1。分析图1可知，不同添加剂处理对主要香气物质的含量变化有很大差异，但是主要香气物质的变化整体趋势依然很明显。乙酸酯和中链脂肪酸乙酯含量在1年期间呈下降趋势，贮藏的前2个月下降幅度较大，后期下降趋缓；高级醇含量逐渐升高，到贮藏的中后期逐渐趋于平稳；脂肪酸、萜烯类和苯乙基类化合物含量先增加，而后下降。Vázquez-Pateiro 等[23]的研究表明，干红葡萄酒中的乙酸酯类物质在36个月贮藏期内持续下降，其他挥发性化合物含量在18个月以后逐渐下降。本研究中，供试酒样在1年贮藏期内，果香酯类物质含量就有较大幅度的下降，所以研究护香工艺对稳定户太8号葡萄酒的香气品质、延长产品货架期至关重要。

图1 户太8号桃红葡萄酒1年贮藏期间主要香气物质的含量变化Fig.1 Changes of major aroma compounds contents in Hutai-8 rose wines during one year storage

2.2 添加剂处理的护香效果

研究发现，多糖、单宁、蛋白质等大分子物质因其对小分子香气成分的吸附作用，从而影响香气成分在气- 液两相分配系数[24-25]，也会延缓一些香气成分的水解损失[26-27]，但是有研究也发现，这些大分子物质对香气成分的作用会因葡萄品种、葡萄酒类型、葡萄酒澄清度等因素而表现出不一样的效果[11,17]。由表1和图1分析可见，本研究中添加剂处理对户太8号桃红葡萄酒中香气物质的影响差异为进一步揭示不同处理对贮藏1年酒样香气物质含量的整体影响，采用主成分分析(PCA)对不同添加剂处理酒样中的主要香气物质含量数据进行统计分析，结果见图2。由图2可知，香气物质主要分布于PC1的正向端，没食子酸处理(Aci组)酒样与对照组酒样距离较近，说明该处理对酒样香气物质含量的整体影响较低。谷胱甘肽处理(Glu组)虽处于PC2的负向端，但其与对照在关键主成分PC1上的位置一致，说明该处理对酒样香气物质的整体影响不大。甘露糖蛋白处理(Man组)在PC1和PC2的负向端，远离主要香气物质的区域，说明其对户太8号酒样香气物质的整体影响是负面的，与对照相比显著降低了主要香气物质的含量。葡聚糖处理(Pu组)酒样处于PC1的正向端，与主要香气物质区域的距离最近，与对照相比葡聚糖处理(Pu组)中乙酸酯、中链脂肪酸乙酯、苯乙基类和己(烯)醇类化合物的含量显著提高，说明葡聚糖处理(Pu组)具有更好的护香作用。

图2 贮藏1年后酒样中主要香气物质在前两个主成分上的载荷及不同添加剂处理酒样的分布Fig.2 Loadings of wine major aroma substances after one year storage in first two PCs and wine distributions of different additives treatments

表1 贮藏1年后不同添加剂处理的户太8号桃红葡萄酒中挥发性成分定量分析Tab.1 Qualitative and quantitative analysis of volatile compounds in Hutai-8 rose wines with different additives treatments after one year storage

明显。与对照相比，葡聚糖处理(Pu组)酒样的中链脂肪酸乙酯、其他酯类(乳酸乙酯、琥珀酸二乙酯)、苯乙基类和己(烯)醇类化合物含量(P<0.05)较高，比对照分别高出10.84%、7.46%、8.98%、20.00%，而其他处理与对照之间的总体差异不显著。

本研究对几种添加剂处理酒样进行了香气特征的感官量化品评，供试酒样香气特征的感官量化分析结果见图3。户太8号桃红葡萄酒经贮藏1年后，其温带水果香、酸果香、花香及甜香类香气的MF值均在50%以上，植物香类香气特征的MF值最低。添加剂处理对酒样香气特征具有影响，其中，与对照组相比葡聚糖处理(Pu组)护香的效果最为明显，该处理酒样的温带水果、甜香、花香和小浆果类香气特征均比对照组的好，其中花香和小浆果类香气的MF值在所有酒样中均为最高。葡萄酒香气的感官分析结果与香气物质的分析结果一致。

图3 不同添加剂处理户太8号桃红葡萄酒贮藏1年后的主要香气特征的MF值Fig.3 MF values of main aroma chacteristics in Hutai-8 rose wines with different additives treatments after one year storage

3 结 论

户太8号桃红葡萄酒的香气物质在含量上以发酵香气物质为主，但气味活性值分析表明，来源于葡萄原料的一些品种香气物质也对葡萄酒的香气有所贡献。研究发现，贮藏期供试葡萄酒样品中的发酵果香酯类物质含量均有不同程度的下降，而萜烯类品种香气物质先升高后下降，总体略有提高。相比对照组，葡聚糖处理(Pu组)具有减缓香气物质水解损失的护香效果，而其他添加剂处理效果一般。感官分析结果也证实了葡聚糖处理(Pu组)在香气特征上的护香效果。本研究结果可为鲜食葡萄所酿酒的护香技术开发贡献实践经验，为户太8号等鲜食葡萄酿酒的工艺优化提供技术支持。