基于16S rRNA高通量测序的江鳕肠道微生物群落结构研究

柳鹏 李玲雪 闫春梅 杜晓燕 郑伟 刘慧吉 高春山

(吉林省水产科学研究院，吉林长春 130033)

江鳕(Lotalota)又名山鳕、山鲶鱼，隶属于鳕形目、鳕科、江鳕属，是鳕科鱼类中唯一的淡水种类。因自然产量低，种质资源脆弱，目前江鳕的濒危等级为易危，是世界抢救性开发品种之一[1-2]。江鳕肉质鲜美细腻，无肌间刺，并以肝脏肥美、精巢味鲜而著称，具有较高的经济价值[3]。目前，关于江鳕胚胎发育[4]、形态特征[5]、营养成分[6]和人工养殖[2]等方面的研究较多，但尚未见有关其肠道菌群结构方面的研究报道。

鱼类肠道微生物作为鱼体内微生态系统的重要组成部分，对宿主的营养、发育、免疫以及生理健康等方面都起着至关重要的作用。肠道菌群结构在不同的鱼类中表现出特异性，且与外界环境条件密切相关，鱼类的生长发育阶段、营养状况、性别等都会对其肠道微生物多样性产生影响[7]。因此，了解鱼类肠道菌群的演替和定植过程，对鱼类肠道微生态系统平衡调控具有重要意义。在鱼类肠道菌群结构的研究方法中，高通量测序技术可以对微生物群落进行精确定量，具有通量高、错误率和成本低等优点[8-9]，已被广泛应用于水体、土壤、动物等不同环境下微生物群落结构的研究[10-11]。

本研究采用MiSeq 16S rRNA高通量测序法，初步分析了江鳕肠道菌群结构，旨在揭示野生江鳕肠道菌群的结构特征，以期为深入研究江鳕肠道菌群形成机制及调控技术提供参考，也为吉林省江鳕种质资源的保护和合理开发提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 样品提取

试验用野生江鳕于2019年11月采集于吉林省牡丹江流域敦化地区(同一水域)。挑选活力较好、体表完整无伤的3龄、4龄、5龄雌、雄江鳕各3尾。用75%的酒精棉擦拭试验鱼体表，在无菌条件下取出整条肠道；再用75%的酒精棉擦拭肠道外壁，用灭菌手术剪剪开肠道；用解剖刀刮取肠道内容物作为样品，保存于-80 ℃冰箱中。样品信息和分组情况见表1。

表1 江鳕肠道内容物样品信息和分组情况

1.2 DNA提取及MiSeq 16S rRNA高通量测序

按照PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒说明书提取样品DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳和分光光度法检测提取DNA的质量和浓度。质检合格的样品于-20 ℃条件下保存备用。用引物338F(5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和806R(5’-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3’)扩增细菌16S rRNA基因的V3～V4区。对PCR产物，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小，并用Agencourt AMPure XP核酸纯化试剂盒纯化。用PCR产物构建微生物多样性测序文库，交由北京奥维森基因科技有限公司使用Illumina MiSeq PE300高通量测序平台进行双端(paired-end)测序。

1.3 数据处理

下机数据经过过滤、拼接后，用Vsearch 2.7.1软件的uparse算法对优质序列进行操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)聚类，相似性阈值为97%。将聚类结果使用RDP classifier算法与Silva128数据库进行比对，得到每个OTU对应的物种分类信息。再利用QIIME 1.8.0软件进行alpha多样性指数分析，包括测序深度指数(goods-coverage index)、菌种丰富度指数(Chao1 index)、谱系多样性指数(PD-whole-tree index)、香农指数(Shannon index)、辛普森多样性指数(Simpson index)等。基于物种注释及相对丰度结果，使用R 3.6.0软件进行物种组成柱状图分析。使用R语言工具进行主成分分析(PCA)、文氏图(Venn diagram)统计分析并作图。

2 结果

2.1 稀释性曲线(rarefaction curve)

以随机抽取到的序列(reads)数为横坐标，以它们所能代表的OTU数目为纵坐标，构建稀释性曲线[12]，结果见图1。当抽样reads数少于20 000时，随着测序条数的增加，各样品的曲线均呈现急剧上升趋势，说明随着测序量的增加，江鳕肠道内容物中有大量菌群被发现。当抽样reads数超过20 000后，随着测序条数的继续增加，各曲线上升态势趋于平缓，表明测序结果基本覆盖了江鳕肠道内容物的菌群。当抽样reads数超过25 000时，曲线还略有上升趋势，可能是因为某些原因肠道中残留了少许的菌群或少数细菌死亡后未被检测出[13]。

图1 样品稀释性曲线

2.2 测序结果及alpha多样性分析

由表2可见，试验共测出的OTU数目为4 561，其中JX3含有OTU数目最多，为2 736个，JX51含有OTU数目最少，为90个。18个样品的覆盖率均达到了97%以上，说明每个样品肠道内容物中的微生物基本都被检测出。

对各样品测序结果进行alpha多样性指数分析发现：JX32的Chao1值最大，物种丰度最大；JX51的Chao1值最小，物种丰度最小；JX32的PD-whole-tree、Shannon、Simpson值最大，物种多样性最高；JX51的PD-whole-tree、Shannon、Simpson值最小，物种多样性最差(见表2)。方差分析(ANOVA)检验显示，3个年龄组江鳕肠道菌群的丰度及多样性差异不显著(P>0.05)，同一年龄的雌、雄江鳕之间，肠道菌群的丰度及多样性差异不显著(P>0.05)。

表2 测序结果及alpha多样性指数统计

2.3 OTU分布和丰度

由图2可见，18个样品共有的OTU数目为4，其中JX32中特有OTU数目(2 732)最多，JX51特有OTU数目(86)最少。丰度占比较高的OUT注释到属为Mycoplasma(支原体属)，其在样品中的丰度占比见表3。

注：花瓣图以每个花瓣代表一个样品，中间的core数字代表的是所有样品共有的OTU数目，花瓣上的数字代表该样品特有的OTU数目。图2 OTU分布花瓣图

表3 共有OTU在各样品的丰度占比及排名

2.4 样品优势菌群分析

由图3可见，在门水平上，江鳕肠道内容物优势菌群为变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、软壁菌门(Tenericutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)，其中变形菌门在94.44%的样品中为优势菌群，厚壁菌门在88.88%的样品中为优势菌群，软壁菌门在83.33%的样品中为优势菌门，梭杆菌门在72.20%的样品中为优势菌群。有少数菌类只在个别样品中为优势菌群。

由图4可见，在属水平上，江鳕肠道优势菌群为Mycoplasma(支原体属)，其在83.33%的样品中为优势菌群。Desulfovibrio(脱硫弧菌属)在样品JX31、JX33、JX41中为丰度占比第一的优势菌群。Macellibacteroides(屠场杆状菌属)在样品JC32中为丰度占比第一的优势菌群。

2.5 PCA分析

由图5可见，在第一象限，样品JC41、JC42的肠道微生物群落形成一个组群，说明这两个样品的肠道微生物群落结构差异较小；在第三象限，样品JC43、JX42肠道微生物群落形成一个组群；在第四象限，样品JX33、JC31、JX41肠道微生物群落形成1个组群。在各个象限，江鳕雌、雄组样品没有聚集，3龄、4龄、5龄组个别聚集在一起，没有分组聚集。

图5 PCA分析图

2.6 组间文氏图

由图6可见，J3组OTU数为3 610，J4组OTU数为2 725，J5组OTU数为3 431。3组共有OTU数目为1 923，占J3组的53.27%，占J4组的70.56%，占J5组的56.05%。

图6 OUT数目对比文氏图

3 讨论

3.1 样品多样性和丰度分析

本研究结果显示，不同年龄组野生江鳕肠道内容物的OTU总数为4 561。徐晟云等[14]研究发现，不同环境鳢(Channamaculate)肠道内容物菌群结构中的样品OTU总数为585。李存玉[15]分析了池塘养殖牙鲆(Paralichthysolivaceus)肠道菌群结构，发现牙鲆肠道样品OTU总数为367。黄丽丽等[16]对新疆冷水鱼肠道微生物群落结构进行了研究，发现其OTU总数为242。与上述鱼类相比，本研究中野生江鳕的OTU总数较多，表明野生江鳕肠道中的微生物物种丰度和多样性更高。本研究发现，不同江鳕样品的OTU数不同，多样性也不同，PCA分析也未发现样品分组聚集。研究表明，鱼类肠道微生物的数量和群落结构与其生存的水环境以及摄食条件等相关[15]。与池塘养殖水体环境相比，自然界中江鳕的生存环境范围大，摄食范围广，天然饵料种类复杂，这可能是野生江鳕肠道中的微生物丰度和多样性更高、不同年龄组PCA分析样品间无聚集的原因。

3.2 样品共有菌群分析

对样品共有菌群的分析发现，Mycoplasma(支原体属)为18个样品共有的微生物种群，且在83.33%的样品中为优势菌群。支原体广泛存在于人和动物体内，其中有许多是人类和各类动物的病原菌。近年来的研究发现，支原体是鱼类肠道正常菌群的一部分。刘铭等[17]应用高通量测序技术研究发现，东海带鱼(Trichiurusspp.)肠道菌群中支原体属为优势菌；Holben等[18]运用16S rDNA测序技术研究发现，支原体在挪威养殖大马哈鱼(Oncorhynchusketa)、苏格兰养殖的大马哈鱼、野生大马哈鱼肠道菌群中的相对丰度分别为25%、81%、96%；Bano等[19]运用变性梯度凝胶电泳(DGGE)方法对来自美国加州5处盐沼的长颌姬虾虎鱼(Gillichthysmirabilis)的肠道菌群进行了研究，也发现支原体与该鱼为共生关系，且在该鱼肠道菌群中占优势地位。本研究发现，每一个样品的肠道菌群中都有支原体属，且为优势菌群，这表明支原体属菌可能在健康野生江鳕肠道菌群中大量存在，并在其健康和生理上发挥着未知的作用。在少数情况下，肠道中固有的微生物会通过直接损坏并穿过肠道上皮层或诱导组织损伤炎症反应造成水产动物疾病[20]，因此不能排除支原体属菌在某些特定情况下导致江鳕患病的可能。虽然支原体通常被认为具有宿主特异性，但已有研究表明，某些菌株也可在宿主间交叉感染[21]，如血营养支原体导致了人畜共患病[22]，人类在开展豚鼠试验时感染支原体[23]，免疫力低下的病人感染了其宠物狗体内存在的犬支原体[24]等，因此，有必要对野生江鳕肠道菌群中的支原体进行研究。支原体有可能会在人和其他物种之间转移，尤其是有免疫缺陷或遭受生理变化(如压力)的人或动物可能更容易感染外来支原体，从而面临潜在的致病后果[25]。

3.3 样品优势菌群及其作用

鱼类肠道菌群的组成分析表明，在鱼类肠道中变形菌门和厚壁菌门是最普遍和共存的细菌类群，而拟杆菌门在不同的鱼类肠道中以较低丰度存在，例如斑马鱼(Brachydanioreriovar.)[26]、草鱼(Ctenopharyngodonidellus)[27]、鲤(Cyprinuscarpio)[28]、褐点石斑鱼(Epinephelusfuscoguttatus)[29]。本研究发现，变形菌门和厚壁菌门是江鳕肠道内容物的优势菌群，但在不同样品中的丰度占比不同。此外，野生江鳕肠道中的优势菌群还有软壁菌门和梭杆菌门。油九菊等[30]在探究东海带鱼肠道菌群结构时也发现，东海带鱼肠道中存在梭杆菌门。

在属水平上分析野生江鳕肠道内容物优势菌群，发现除各组共有的支原体属外，Desulfovibrio(脱硫弧菌属)在样品JX31、JX33、JX41中为丰度占比第一的优势菌群。Macellibacteroides(屠场杆状菌属)在样品JC32中为丰度占比第一的优势菌群。脱硫弧菌的代谢产物是慢性胃肠道疾病的潜在致病因素[31]，且该菌在肠道疾病人群与健康人群之间存在明显差异[32]。杨新宇等[33]在分析氨气对小鼠肠道菌群的影响时发现，脱硫弧菌是氨气胁迫肠道损伤的标志性菌群。刘寒等[34]在分析日粮中高糖高脂对团头鲂(Megalobramaamblycephala)肝脏及肠道微生物菌群组成的影响时发现，屠场杆状菌属可能与脂肪代谢相关。据此推测，屠场杆状菌属在野生江鳕肠道内可能有类似的作用。鱼类肠道菌群与其生活的水环境息息相关，水体环境的好坏直接影响到水生动物肠道菌群的优势种群，一些外来细菌也可能会改变鱼类的肠道菌群结构。本次研究中发现的不常见菌群可能与野生江鳕生活的环境有关，这有待采集水体样本开展进一步研究。