特异性促炎症消退介质在骨病治疗中的研究进展

马成 谢兴文 李宁 闫文 高亚雄 高亚伟

1.甘肃中医药大学,甘肃 兰州 730000

2.甘肃中医药大学附属医院,甘肃 兰州 730099

骨骼是一个独特的器官,它不断地进行骨重塑,为身体提供支持。负责成骨的成骨细胞和参与骨吸收的破骨细胞的协同作用对维持骨内稳态至关重要。炎症是组织对有害刺激的保护性反应,炎症的产生在一定程度上是有益的,可以将免疫细胞招募到组织损伤或感染的部位,引导有害刺激的移除和愈合过程的启动[1]。炎症不能及时消退则会导致局部或全身性炎症慢性化,各种应激源引起的慢性炎症可通过分泌各种炎症细胞因子,激活骨微环境,破坏成骨细胞和破骨细胞之间的微妙平衡[2],从而引起和加重各种严重疾病[3]。许多骨病中长期伴随的慢性炎症会导致骨吸收并影响骨骼健康,包括骨质疏松症(osteoporosis, OP)、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)和牙周炎[3]。随着慢性炎症性疾病的治疗方法从“抗炎”向“消炎”转变[4],在促进慢性炎症消退的过程中,参与促进炎症消退的分子是否也有助于骨病的缓解或逆转是值得思考的问题[5],以解决慢性炎症为切入点或许能为骨病的治疗提供新的机会。特异性促炎症消退介质(specialized pro-resolving mediators, SPMs)是一类多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)的脂类代谢产物,目前较多研究[4,6]证明,SPMs可以促进炎症消退和组织的再生,清除微生物,并通过特定的细胞和分子机制减轻疼痛,因此考虑通过SPMs控制慢性炎症来治疗骨病是一个可实现的目标。

1 慢性炎症对骨骼的破坏

炎症的触发因素目前尚不清楚,但是许多内源性和外源性因素导致了炎症过程[7]。炎症是一把双刃剑,它是免疫监视和宿主防御的重要组成部分,在骨骼急性损伤(例如骨折)的情况下,会引发重要的局部炎症反应,有利于损伤部位的恢复。然而,如果这种适应性反应持续时间长、程度低、症状少(如慢性炎症性疾病),反而会阻碍损伤的恢复,并导致负钙平衡、骨丢失和骨质疏松[8]。成骨细胞、骨细胞和软骨细胞在骨骼发育和修复过程中形成骨和软骨,而破骨细胞则介导骨吸收。在正常的生理条件下,骨基质的合成和破骨细胞引起的骨吸收之间的平衡可以维持骨的平衡。但是骨骼系统对慢性炎症非常敏感,在存在促炎症细胞因子的情况下,骨形成滞后于骨吸收。不同慢性骨病中骨丢失机制的相似之处可能与炎症细胞有关[9],在持续的慢性炎症中,免疫系统的长时间激活和相互作用导致骨破坏性自身免疫疾病,如RA和OP[10]。先天免疫系统激活产生的炎症信号使免疫细胞募集[11],导致促炎症细胞因子释放,促进了破骨细胞的形成和活动,对成骨细胞的存活产生不利影响[12]。其特点是中性粒细胞、巨噬细胞和T细胞对受影响组织的慢性浸润,随后破骨细胞被激活,骨转换加速,最终导致骨质流失[13]。过往研究[14]已多次提出在OP中建立全身性、慢性、低水平炎症作为其发病机制的一部分。在包括牙周炎和RA在内的骨骼疾病中,持续的慢性炎症会导致骨量和体积的损失[15],并且一直伴随着核因子KappaB受体激活剂配体(receptor activator of nuclear factor-κB ligand, RANKL)的局部表达增加[16]。也有动物模型表明,慢性炎症可能会抑制局部成骨细胞的骨形成[31]。

2 SPMs概述

PUFAs是哺乳动物细胞膜的主要成分,包括花生四烯酸(arachidonic acid, AA)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)与二十二碳五烯酸(docopentaenoic acid, DPA)。简言之,所有SPMs的生物合成是由四种PUFAs氧化启动的,SPMs包括四个主要的生物活性脂类家族:源自AA的脂氧素(LXA4和LXB4)、源自EPA的E系列消退素(RvE1-RvE4)、源自DHA的D系列消退素(RvD1-RvD6)、保护素(PD1和PDX)和Maresins(MaR1-MaR2)。这些脂质介质主要由组织驻留的巨噬细胞、招募的单核细胞和树突状细胞在局部产生,也可以由中性粒细胞、破骨细胞和血管内皮细胞产生,并通过同源的G蛋白偶联受体发挥作用[6],产生抗炎介质、阻止白细胞浸润、刺激非炎性单核细胞募集以及减少促炎症细胞因子和活性氧(reactive oxygen species, ROS)的分泌,诱导巨噬细胞吞噬细胞碎片,杀死和清除病原体来激活内源性炎症消退程序,缩短炎症消退时间,促进组织再生和愈合[18-19]。

3 SPMs促消炎的优势

对于伴随着慢性炎症的骨病来说,促进炎症消退是维持骨平衡的关键环节[3]。传统的非甾体抗炎药对骨愈合有负面作用,此外还诱发严重的副作用[20]。虽然目前一些抗骨质疏松药物也具有抗炎活性,但是这种抗炎活性似乎不足以减少慢性炎症,在服用抗骨质疏松药物的OP患者中仍不断检测到全身性、慢性、低水平炎症[21]。在这方面,糖皮质激素是最有效的抗炎药物,但是它导致OP和骨折风险升高[22]。因此,这些药物在促进慢性炎症消退方面的应用是有限的。相比之下,SPMs主要被证明可以在各种炎症性疾病的实验模型中缓解炎症,且没有副作用。在炎症与骨吸收或骨破坏同时存在的情况下,SPMs不仅有利于局部炎症消退,也可能是一种新的骨保护因子[16]。研究结果[23]表明,RvE1在炎症条件下影响骨重塑,这种影响部分是由于对骨细胞的直接作用,针对骨病中的慢性炎症,SPMs是活跃的生化信号分子,促进凋亡细胞通过淋巴管清除,并恢复到平衡状态以主动消退炎症。同时在慢性炎症动物模型中的研究报告[24]显示,SPMs具有明显的骨保护活性,从而抑制骨丢失。在这种情况下,通过无毒副作用的SPMs成功促进炎症消退,对于减少各种慢性炎症相关疾病的发展至关重要。在包括OP在内的慢性炎症相关疾病的临床前模型中,SPMs特别是消退素显示出令人鼓舞的治疗效果[23]。

4 SPMs在骨病治疗中的应用

4.1 SPMs通过促消炎作用保护骨骼

4.1.1SPMs控制炎症发展:肿瘤坏死因子α(tumour necrosis factor-α, TNF-α)被证明直接作用于破骨细胞及其前体,与RANKL协同促进破骨细胞生成[25]。在TNF-α诱导的局部小腿骨溶解的小鼠模型中,RvE1的全身给药降低了小腿骨的吸收率[23]。辅助性T细胞17(T helper 17cells, Th17)的激活是炎症慢性化的关键步骤,白细胞介素(interleukin-, IL-)17是由Th17细胞亚群诱导的炎症细胞因子,通过刺激RANKL的表达起到破骨的作用,并激活先天免疫系统产生促炎症细胞因子(TNF-α、IL-1和IL-6),使疾病状况恶化[26-27]。RvE1通过抑制IL-17的表达,逆转Th17的激活来调节炎症的慢性化[28]。Th17/Treg的不平衡已被证实参与了RA的发病[29],RvD5强烈抑制Th17细胞分化,促进Treg细胞分化,纠正Th17/Treg细胞的失衡,减少CD4+T细胞增殖,在RA小鼠模型中起到抑制破骨细胞分化的作用[30]。在RA中,RvD1上调成纤维样滑膜细胞中miRNA-146a-5p,同时下调miRNA-155和miRNA-181来抑制CTGF和炎症介质的表达,减少血管翳生成和软骨损伤,缓解RA的进展[31]。体内给予RvD1可减少胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis, CIA)小鼠模型的骨吸收并降低血清中的促炎症介质水平(TNF-α、IL-17、IL-6、IL-1β、INF-γ和PGE2)[32]。RvD1还能抑制从骨关节炎患者获得的骨关节炎成纤维样滑膜细胞(osteoarthritis fibroblast-like synoviocytes, OA-FLS)的增殖,OA-FLS分泌IL-1β,IL-1β的分泌可以触发软骨细胞和滑膜的炎症,影响软骨细胞合成基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP),包括MMP1和MMP13,进而破坏关节软骨[33],这些结果表明,RvD1对炎性滑膜具有靶向治疗作用[34]。

4.1.2SPMs增强抗炎作用:体外细胞实验中RvD1减少破骨细胞分泌TNF-α、IL-1β、干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、前列腺素E2(prostaglandin E2, PGE2)和RANKL,并同时增强破骨细胞对IL-10(一种抗炎细胞因子)的分泌[32]。Jiang W等[35]采用生物信息学方法对从骨关节炎大鼠模型获得的膝关节软骨细胞进行体外研究,发现RvD1通过NF-κB、p53、MAPK、PI3K-AKT信号传导途径减轻骨关节炎的恶化。将一种封装RvD1的纳米脂质体制剂(Lipo-RvD1)在小鼠膝关节进行注射,已经证明能够增加滑膜中M2巨噬细胞的比例,促进炎症的消退,减轻小鼠骨关节炎模型中不断发展的软骨损伤[36]。

4.1.3SPMs减少ROS分泌:ROS是氧正常代谢的自然副产物,当其浓度超过一定范围时,会干扰氧化剂-抗氧化剂的平衡,这种紊乱会导致许多炎症疾病,如糖尿病性骨质疏松症[37]。高糖条件诱导了ROS的产生,抑制了破骨细胞的胞吐,增强了破骨细胞的骨吸收,而胰岛素和LxA4联合治疗逆转了这一现象[38]。

4.1.4SPMs改善牙周炎症环境:成骨和成牙的过程是相似的,牙周指标和骨密度之间有较高的相关性[39]。RvE1已被证明可以治疗牙周炎,并在各种动物模型中使牙槽骨再生[40-42]。在牙周炎中,牙槽骨破坏的机制是由局部炎症导致的,可发展为全身性、慢性、低水平炎症[43]。牙周炎模型兔子局部注射RvE1后,与中性粒细胞过度激活相关的炎症反应明显减轻[44]。最近,使用大鼠牙髓损伤模型发现,RvE1促进牙髓微环境中炎症的解决和牙本质的修复,同时增强了有或没有脂多糖刺激的人牙髓干细胞的趋化、增殖和成牙本质能力[45]。牙髓成纤维细胞(dental pulp fibroblasts, DPFs)上存在ChemR23,在相关炎症早期(牙髓暴露后24 h内)给予RvE1时,RvE1可以抑制DPFs的激活,抑制牙髓炎早期阶段相关的牙髓炎症[46]。此外,RvE1支持其他类型的牙齿相关干细胞(人牙周膜干细胞)在炎症条件下的再生特性,前期逆转了促炎的影响,改善了炎症环境下人牙周膜干细胞的活力和迁移能力,同时在基因和蛋白水平上调成骨细胞特异性因子(OSF-2)、腱调蛋白抗体(软骨调节素样1蛋白)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)[47]。体外细胞实验验证了人牙周膜细胞和破骨细胞前体之间的细胞间信号传导在炎症诱导的破骨细胞分化中的重要性,并证实了LxA4在这一过程中的抑制作用[48]。

4.2 SPMs抑制骨吸收

破骨细胞是在巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-stimulating factor, M-CSF)和RANKL的作用下从造血干细胞的单核细胞-巨噬细胞系中产生的,由单核前体发展而来,融合后形成多核成熟破骨细胞,从而能够进行骨吸收[49]。除了抑制炎症反应,RvE1还独立和直接地抑制破骨细胞融合来减弱骨吸收,有研究[50]发现RvE1针对破骨细胞成熟的后期阶段作用更明显,特异性靶向下调破骨细胞关键融合蛋白树突状细胞-特异性跨膜蛋白(DC-STAMP),并降低转录因子NFATc1的DNA结合活性,限制破骨细胞融合,使破骨细胞的形成减少。有研究结果[16]表明RvE1通过干扰破骨细胞的分化来抑制破骨细胞的生长和骨吸收,在RvE1存在的情况下,破骨细胞的生长和吸收陷窝的形成明显减少。在体外炎症条件下,RvE1抑制了培养的小鼠破骨细胞的分化[51],并降低了破骨细胞中RANKL/OPG的比例,抑制牙周炎引起的骨吸收和组织破坏[50]。总之这里的结果表明,RvE1在体外阻断了破骨细胞的分化和骨吸收,表明其骨保护作用与已知的促炎症消退作用不同。RvE1阻断破骨细胞分化、生成的作用可能是通过其同源受体BLT1和ChemR23介导的,这些受体由破骨细胞表达[50,52]。白三烯B4(leukotriene B4, LTB4)是一种促炎症的AA衍生物,已知可在体外和体内增强骨吸收,与促进破骨细胞融合有关[53]。白三烯B4受体亚型1(leukotriene B4 receptor subtype 1, BLT1)是LTB4和RvE1的受体[50,52],由于LTB4与RvE1竞争BLT1的结合,且LTB4拮抗剂U75302能阻止RvE1对破骨细胞生长的调节,表明BLT1介导了RvE1对破骨细胞的影响,可能是RvE1在破骨细胞培养中的主要作用部位[16]。作为支持,抑制BLT1的表达可以阻止RvE1促进特异性破骨细胞融合蛋白的调节,随后在体外增加破骨细胞的生成,在该研究中,RvD1也能抑制体外破骨细胞的分化和激活[50]。同样有体外研究证明,发现RvD1对破骨细胞的抑制与抑制抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K和DC-STAMP的表达有关,能显著抑制破骨细胞分化和激活[32]。

4.3 SPMs促进骨形成

有体外研究[23]发现RvE1直接作用于成骨细胞以降低炎症条件下升高的RANKL水平,即RvE1调节RANKL/OPG的比例,有利于骨的保存。PGE2诱导成骨细胞中RANKL的表达,而PGE2又受IL-17强烈诱导[54-55]。研究[56]显示RvE1抑制IL-17诱导的环氧化酶2(COX-2)和膜结合型前列腺素E2合酶1(mPGES-1)mRNA的表达,随后抑制MC3T3-E1细胞中PGE2的产生,从而抑制成骨细胞中RANKL表达。研究发现LxA4增加了血清中OPG的浓度,降低了RANK/OPG比率[57]。

RvD1显著减少大鼠颅骨缺损模型中促炎症细胞因子IL-1和TNF-α,使M2巨噬细胞产生更多的生长因子,如BMPs和VEGF,以促进成骨和血管生成,在控制炎症微环境、促进骨愈合和血管生成方面发挥了作用[58]。RvD1的合成类似物在大鼠急性动脉损伤后减弱了慢性炎症导致的新内膜增生[59]。Vasconcelos等[60]用嵌入RvD1的多孔三维壳聚糖支架填充大鼠股骨缺损的愈合情况。结果表明,与对照缺损相比,RvD1可以促进骨愈合,如促进骨形成、增加骨小梁厚度和I型胶原,这些结果可能与RvD1调节植入材料炎症反应的能力有关。

MaR1在老年小鼠中给药后能够对抗骨损伤后的慢性炎症从而改善骨折的愈合[61],在这项研究中,MaR1治疗降低了炎症生物标志物的循环水平,并减少了老年小鼠骨痂内M1巨噬细胞的数量,促使巨噬细胞由促炎(M1)表型向抗炎(M2)表型转变,Clark等[62]证明,低效愈合可能不是因为缺乏抗炎巨噬细胞,而是因为促炎表型的M1巨噬细胞过剩造成的。在老年小鼠骨折模型中,MaR1治疗可促进骨再生,在另一项研究[63]中,在大鼠拔除的磨牙窝局部应用MaR1可加速伤口愈合和牙槽骨再生。LGR6是一种G蛋白偶联受体,此前研究证明了LGR6是小鼠成骨祖细胞的标志物,并在骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)体外成骨分化过程中动态表达,具有成骨功能[64]。Lgr6在人类BMSCs和成骨细胞的体外成骨分化过程中也动态表达[65],对中国绝经后女性的定向基因测序后发现LGR6与骨质疏松有关[66]。在一项横断面研究中,发现与正常人相比,绝经后女性MaR1血清水平明显降低并与OP的严重程度相关[67]。在体外成骨过程中,MaR1通过其同源受体LGR6发挥作用,刺激cAMP信号传导,显著促进了成骨祖细胞增殖,这是触发抗骨质疏松药物的骨同化活性的关键机制因素[68]。

5 小结与展望

老龄人口规模的扩大导致越来越多与慢性炎症相关的骨骼疾病出现,如OP、RA和牙周炎。促进慢性炎症的主动消退是一个新的方向,在传统抗炎药物存在不同程度的毒副作用并且疗效甚微的情况下,需要确定新的干预措施。SPMs作为无毒无害的脂类化合物,近年来不断有新的发现,在衰老、肿瘤、心血管以及代谢疾病方面有较大突破,在促进炎症主动消退方面取得了显著的成效。已经在各种临床前炎症模型中观察到SPMs、包括其模拟物和受体激动剂在体内外对骨骼健康的有益影响。虽然目前对SPMs及其受体信号通路的认识不足,SPMs的快速失活以及它们复杂昂贵的化学合成方式限制了SPMs的应用潜力[69],但是稳定的小分子SPMs模拟物和受体激动剂已成为潜在的合适药物,可能是一种有希望的、新颖的补充治疗方法。这些化合物能够通过明确的机制控制慢性炎症,包括限制中性粒细胞浸润、诱导中性粒细胞凋亡、调节促炎症介质的表达、将巨噬细胞重新编译为抗炎表型、诱导疼痛缓解、刺激受损组织的修复,所有这些都是炎症消退过程的组成部分。在这些新化合物中,最有应用前景的是LxA4受体激动剂(ALX/FPR2),属于甲酰基肽受体家族,能合成在体内稳定性较强的模拟物,在许多基于炎症的临床前研究包括关节炎、败血症、神经炎症和慢性阻塞性肺疾病的小鼠模型中显示出明显的促消炎作用[3]。

尽管有越来越多人认识到慢性炎症在骨病发病机制中的重要作用,并且观察到慢性炎症对骨的长期破坏,但其产生机制仍不清楚。现在的主流观点认为雌激素水平下降、免疫系统功能紊乱和肠道菌群失调可能是导致慢性炎症的主要原因。进一步明确它们之间的因果关系、研究慢性炎症的产生机制是未来应该考虑的方向。