骨质疏松症中lncRNA可调控的骨代谢相关因子

余子维 陈剑峰 邓乔松 李冠莘 张楠

南京中医药大学无锡附属医院,江苏 无锡 214000

骨质疏松症(osteoporosis,OP)是由于骨代谢失衡导致的骨吸收大于骨形成、进而使骨的脆性增加而易引起骨折的一种疾病。我国40岁及以上人群中男性的骨质疏松症患病率为5.0 %,女性为20.6 %,同时具有女性患病率远高于男性、50岁及以上人群的患病率远高于其他年龄段、绝经后妇女的患病率远高于绝经前妇女等特点,尤其对于绝经后妇女而言,骨折的风险大大增加,需要尽早进行预防和治疗[1-2]。许多危险因素都可以导致骨密度的降低,例如内分泌疾病(糖尿病)、胃肠道疾病(炎症性肠病)和风湿性疾病等。此外,一些药物也能够导致骨质丢失,如免疫抑制剂、糖皮质激素和抗惊厥药等[3]。目前抗骨质疏松药物主要包括抗重塑药物、骨合成代谢药物两大类。这些药物可维持或改善骨密度并降低骨折风险,然而接受这些药物治疗的患者可能会出现严重的副作用。例如,长期使用双膦酸盐会增加两种罕见危害的风险:非典型股骨骨折和颌骨坏死,雌激素-孕激素增加了未指明的骨质疏松症或骨质减少状态的女性患心血管疾病和认知障碍的风险,也增加了浸润性乳腺癌的风险[4]。此外,患者对于药物治疗的依从性和持续性的不理想亦会导致骨折风险的增加[5]。因此,迫切需要为骨质疏松症的治疗寻找新的靶点。

非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是一类不具有编码蛋白质能力的RNA,主要包括小非编码RNA如miRNA、siRNA、circRNA等以及长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)。其中LncRNA的长度大于200个核苷酸,虽然lncRNA不编码蛋白质,但lncRNA生物学的某些方面与mRNA相似。大多数lncRNA由RNA聚合酶II(Pol II)转录,并通过聚腺苷酸化稳定,而非聚腺苷酸化的lncRNA可以通过二级结构稳定,例如3'末端的三螺旋结构[6]。有研究表明lncRNA在表观遗传修饰和基因调控中发挥着重要作用,具有调节多种生理和病理过程的能力[7],因此近年来出现了许多有关lncRNA的心血管疾病、自身免疫性疾病、癌症以及神经退行性疾病的研究。此外,有研究证明,绝经后骨质疏松症患者(OP组)与健康对照组(NC组)相比,有70种lncRNA存在表达差异[8],因此LncRNA可能为治疗骨质疏松症的潜在靶点。

1 lncRNA与骨保护素

骨保护素(osteoprotegerin,OPG)是由成骨细胞(osteoblast,OB)产生的分泌型糖蛋白,主要通过OPG/RANK/RANKL系统影响骨代谢。此信号传导通路发现于破骨细胞的分化过程,主要作用机制是OPG与RANK竞争性的结合RANKL,阻隔RANK与RANKL之间的结合,从而延缓破骨细胞的分化,抑制骨吸收[9]。

LncRNA H19在肝癌细胞中过表达可增强其在体外诱导破骨细胞成熟的能力,促进其在体内发生骨转移。黄昭[10]在研究中发现H19调控的基因主要位于MAPK信号通路。过表达H19的细胞及对应小鼠骨转移灶中,p-p38及其下游效应蛋白表达水平降低,OPG表达水平下调,敲低H19则表达水平升高。在敲低H19的细胞中抑制p38 MAPK信号通路后,OPG表达水平下调。同时,回复因敲低引起的p-p38上调后,OPG表达水平提高。因此H19可以通过介导p38 MAPK通路的失活来抑制OPG的表达。近几年有更多的研究表明OPG的甲基化状态可能是骨质疏松症发病的重要因素之一[11],Yu等[12]研究发现lncRNA SNHG1能够通过影响OPG的甲基化状态来抑制OPG的表达。过表达lncRNA SNHG1对OPG的表达有明显的抑制作用,而沉默SNHG1则增强了OPG的表达。此外,用DNA脱甲基剂5-Aza处理骨髓间充质干细胞(BMSC)增加了OPG的表达水平,抑制了OPG的甲基化,而SNHG1的过表达则消除了这些影响。为了进一步证实这一结论,又研究了lncRNA SNHG1在体内骨质疏松症小鼠模型中的影响。转染sh-SNHG1(沉默SNHG1)可明显改善双侧卵巢切除术(OVX)组的骨质疏松变化,而与sh-OPG(沉默OPG)共同转染则部分逆转了SNHG1沉默的效果。因此,lncRNA SNHG1能够增强OPG的甲基化,从而下调OPG的表达。

激素类药物治疗能够抑制BMSC的增殖[13],Fu等[14]研究发现LncRNA NORAD在股骨头坏死(SONFH)组织和地塞米松(Dex)处理的骨髓间充质干细胞中表达下调,而miR-26a-5p表达上调。通过RT-qPCR发现,敲低NORAD后,检测到OPG表达水平降低,RANK、RANKL表达水平升高。NORAD过表达后,OPG表达量增加,RANK和RANKL表达量减少,而转染miR-26a-5p模拟物则明显抑制了这些影响。此外,NORAD的过表达使细胞增殖能力增强,细胞凋亡受到抑制,而miR-26a-5p的过表达则削弱了这些效应,因此lncRNA NORAD能够通过调控miR-26a-5p影响OPG的分泌。

2 lncRNA与骨特异性碱性磷酸酶

骨特异性碱性磷酸酶(bone specific alkaline phosphatase,BALP)是非特异型碱性磷酸酶的一种亚型,由成骨细胞分泌的一种细胞外酶,主要在成骨过程中水解磷酸酯,促进沉积羟基磷灰石并水解焦磷酸盐,解除对骨矿物质形成的抑制作用,有利于骨形成。因此,BALP是反应成骨细胞活性和骨形成的特异性指标,其浓度反映了骨代谢的总体情况[15]。

lncRNA H19在骨和软骨发育中起着重要作用,可导致软骨细胞外基质降解,能够用作评估骨关节炎(OA)进展和预后的诊断[16],Zhou等[17]研究发现lncRNA H19在骨关节炎患者的外周血表达量显著高于对照组,这提示lncRNA H19可能与骨关节炎的发生有关。此外,Pearson相关性分析显示,lncRNA H19与骨关节炎患者中骨代谢指标Ⅰ型前胶原氨基端原肽(PINP)、骨钙素N端中分子片段(N-MID)、骨钙素(BGP)和BALP呈负相关。其他研究报告了miR-141可以通过调节lncRNA H19和其靶基因miR-675来调节成骨细胞的增殖[18],因此猜测BALP的分泌可能与miR-141/lncRNA H19/miR-675通路有关。Pan等[19]的研究采用qRT-PCR定量检测发现lncRNA HAGLR在骨折组织中下调。敲低HAGLR降低了小鼠成骨细胞(MC3T3-E1)的增殖,提高了凋亡率,下调了BALP、骨钙素以及转化生长因子β受体2(TGFBR2)的表达。Yang等[20]研究发现OP模型组的血清雌二醇(E2)水平比lncRNA p21组显著下降,血清骨形成标志物[BGP、Ⅰ型前胶原氨基端原肽(PINP)和BALP]模型组显著高于lncRNAp21组,然而模型组中Wnt/β-catenin信号通路[21](一种成骨细胞通路,活化后能够上调BALP活性的表达)的表达水平显著低于lncRNAp21组。因此,lncRNAp21能够通过增加E2分泌激活Wnt/β-catenin信号通路,最终刺激模型组的成骨分化,促进分泌BALP。Shen等[22]研究发现骨质疏松症大鼠股骨组织中lncRNA NEF、ALP表达水平低于正常组,抗酒石酸盐酸性磷酸酶(TRAP)、组织蛋白酶K(CTSK)表达水平高于正常组。Pearson相关分析显示lncRNA NEF与骨质疏松大鼠的ALP表达呈正相关,与TARP、CTSK呈负相关性。此外,与阴性对照组相比,感染敲低LncRNA NEF的慢病毒细胞的ALP活性与LncRNA NEF水平均降低。因此,lncRNA可能通过调控ALP的表达,参与成骨分化的过程。

3 lncRNA与肿瘤坏死因子α

肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)有α和β两种亚型。TNF-β激活凋亡和炎症信号与TNF-α相似,通过淋巴毒素-β(LTβR)受体发出信号,并激活典型和非典型的NF-κB信号。LTβR通过刺激NF-κB途径在炎症、淋巴器官形成以及保留B和T淋巴细胞的结构和分区中发挥重要作用[23]。TNF-α是破骨细胞的重要调节因子,可以参与骨骼系统和免疫系统代谢。TNF-α可以促进破骨祖细胞的分化以及破骨细胞前体细胞的有丝分裂,刺激破骨细胞增殖[24],增强破骨细胞的形成与活性。在病理性骨缺失如绝经后骨质疏松、慢性炎症引起的骨吸收组织中,TNF-α浓度均有提高,说明TNF-α是调节骨代谢的重要因子[25]。

LncRNA在绝经后骨质疏松症(POP)中起着重要的关键作用,Yu等[26]的研究通过随访POP患者发现,lncRNA CASC11和TNF-α的血浆水平在POP患者中显著上调,此外在破骨细胞中过表达CASC11后,TNF-α上调,POP患者接受治疗后CASC11和TNF-α的血浆水平下降。因此,lncRNA CASC11可通过上调TNF-α促进骨吸收并推动POP的发展,但具体调控的分子机制尚不清楚,缺乏体内实验去进一步证明它们之间的作用。TNF-α可通过激活MAPK/NFATc1通路诱导破骨细胞的分化和成熟[27],Zhu等[28]研究发现miR-454-3p在293 T细胞中被敲低后,lncRNA MEG8和TNF-α的表达水平显著增加,MEG8在293 T细胞中过表达后,miR-454-3p的表达量下降,TNF-α的表达量升高,促进小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)细胞破坏骨骼。因此,lncRNA MEG8/miR-454-3p靶向TNF-α形成调控网络促进骨破坏。Hippo/YAP通路是成骨细胞分化的重要信号通路之一,TNF-α可以通过调节Hippo/YAP信号通路影响BMSC的成骨分化[29],Han等[30]研究发现TNF-α浓度越高,小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)增殖率越低,lncRNA TUG1的表达水平越低,而过表达lncRNA TUG1后能够逆转TNF-α对MC3T3-E1细胞的凋亡作用,抑制Hippo/YAP通路活性,促进成骨分化,但敲低TUG1则减弱了这些效果。因此,可以确定lncRNA TUG1能够改善TNF-α对成骨分化的抑制作用,但这两者之间的调控作用还不清晰,需要进一步探索。

4 lncRNA与转化生长因子β

转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)是能够刺激细胞表型发生转化的生长因子,是参与骨形成和骨修复的重要调节因子。在骨组织中,TGF-β广泛存在,是参与骨代谢的重要细胞因子,能够刺激成骨细胞的增殖和分化,促进骨形成,而对破骨细胞具有促进和抑制的双重作用。TGF-β还可影响胶原合成,参与调节骨和软骨形成,促进骨修复[24]。当血中TGF-β浓度下降时,可诱发骨质疏松症等代谢性骨病,而在癌症的骨转移过程中,TGF-β却能够促进大量破骨细胞成熟,导致骨溶解,形成骨质破坏。

lncRNA-SOX2OT在促进骨转移(BoM)中起着至关重要的作用,Ni等[31]研究发现用敲低lncRNA-SOX2OT的外泌体诱导处理后,RAW264.7细胞中TGF-β的表达水平降低,过表达lncRNA-SOX2OT后,细胞中则观察到相反的结果。此外,BoM的特征是通过调节TGF-β/pTHrP/RANKL信号通路导致破骨细胞异常分化和功能障碍。因此,lncRNA-SOX2OT可以通过调节破骨细胞中的TGF-β/pTHrP/RANKL信号通路来调节破骨细胞分化并刺激BoM。在癌症的骨转移中,转移到骨骼的癌细胞由TGF-β信号驱动,这可能导致异常的骨重塑过程,Lang等[32]研究发现在lncRNA PCAT7高表达样本中TGF-β信号传导也显著富集,PCAT7过表达和miR-324-5p敲低均有效增强TGF-β信号传导的荧光素酶活性,而敲低PCAT7或miR-324-5p过表达均抑制其活性。此外,miR-324-5p模拟物能够逆转过表达PCAT7促进TGF-β活性的作用,且敲低PCAT7导致TGF-β活性减弱的作用,能够被miR-324-5p抑制解除。因此,认为PCAT7通过抑制miR-324-5p激活TGF-β信号促进骨转移。骨髓间充质干细胞(BMSC)是多潜能干细胞,在一定条件下可以分化成各种细胞,其增殖和凋亡的调控是影响骨质疏松的关键因素之一[33],Li等[34]研究发现敲低lncRNA RAD51-AS1促进了BMSC细胞凋亡,减弱细胞活力和成骨分化,而过表达RAD51-AS1则起到了相反的作用。此外,敲除RAD51-AS1后,SMAD7和SMURF2蛋白水平明显增加,然而,RAD51-AS1的过表达则出现相反的效果。在机制上,有研究发现SMURF2能与SMAD7结合形成E3(泛素-蛋白质连接酶),针对TGF-β受体进行降解以抑制TGF-β通路[35]。因此,lncRNA RAD51-AS1能够通过SMAD7和SMURF2激活TGF-β信号通路进而促进BMSC的细胞增殖和成骨分化。

5 lncRNA与白细胞介素

白细胞介素(interleukin,IL)是由多种细胞产生的、具有重要调节作用的一类细胞因子,在传递信息、激活与调节免疫细胞,介导T、B细胞活化、增殖与分化及参与炎症反应中起到重要作用。其中IL-1和IL-6都属于细胞因子家族成员之一。大多数的有核细胞皆可以产生IL-1,IL-6可由内皮细胞、成纤维细胞、成骨细胞和T细胞等合成。IL-1和IL-6可以促进破骨细胞增殖与分化,加强骨吸收、抑制成骨细胞活性、破坏骨形成,最终导致骨代谢失衡、骨密度下降,诱发骨质疏松[36]。

有研究表明,癌细胞分泌的因子会影响骨细胞的生长和分化,而骨微环境分泌的因子会促进癌症向骨转移[37],Aimy Sebastian等[38]研究发现将溶骨性前列腺癌细胞系(PC3)与WT成骨细胞共培养,可使PC3细胞中与癌症相关的lncRNA MALAT1上调,与单独的PC3相比,MALAT1在与WT成骨细胞共培养的前列腺癌细胞中被上调,这表明成骨细胞分泌的因子会上调MALAT1。另外,由成骨细胞分泌的因子已被证明在调节癌症向骨转移方面起着重要作用[39],而IL-6是成骨细胞分泌的因子且在成骨细胞共培养中出现了差异性表达。因此,IL-6的分泌可能影响到lncRNA MALAT1的表达。Gao等[40]研究发现RANKL能够促进小鼠巨噬细胞RAW264.7分化为破骨细胞,但IL-10削弱了这一作用,同时破骨细胞的标志物表达水平下降,表明IL-10可以抑制巨噬细胞向破骨细胞的分化。在RANKL诱导RAW264.7后,lncRNA MEG3的表达升高,然而,IL-10的添加削弱了这个效果,通过检测发现IL-10的添加增加了细胞中MEG3的甲基化水平,抑制MEG3表达。此外,敲低MEG3,破骨细胞标志物水平显著降低。因此,IL-10可能通过lncRNA MEG3抑制破骨细胞分化,从而抑制骨溶解。

除上述五个和骨质疏松相关的因子能够被lncRNA调控外,还有甲状旁腺素(PTH)、骨钙素(BGP)、Ⅰ型胶原交联C-末端肽(CTX)、胰岛素样生长因子(IGF)等,能够被lncRNA GAS5[41]、lncRNA HHIP-AS1[42]、lncRNA BCAR4[43]、lncRNA AC132 217.4[44]、lncRNA PCAT6[45]等长链非编码RNA所调控。

6 小结

综上所述,许多lncRNA可以通过不同的信号通路影响与骨形成和骨吸收相关因子的分泌。目前,研究中发现最多的lncRNA有H19、HAGLR、NORAD、MALAT1和DANCR可通过充当内源性miRNA海绵来调节基因表达。此外,一些lncRNA,如lncRNA TUG1、lncRNA TUG1、lncRNA RAD51-AS1也可以通过调控Wnt/β-catenin、Hippo/YAP、TGF-β信号通路来影响骨代谢。然而,对于骨质疏松症相关领域的lncRNA研究仍处于初期,在未来的研究中,仍有许多问题亟待解决。尽管本综述概括了lncRNA调控的相关因子,但大多数lncRNA的作用机制尚未得到完整研究,且研究仅进行了体外实验,并没有进行骨质疏松动物模型的体内验证实验。因此,需要进一步研究lncRNA对OP相关因子调控的具体作用机制。其次,目前已知lncRNA能够调控的OP相关因子的种类较少,仅仅只有一小部分。因此,研究人员应加大对lncRNA其他相关因子的研究。