生长因子对活髓治疗修复作用的研究进展

梁介技 杨媛文 黎淑芳

随着生物活性材料的不断发展，诊疗技术以及微创理念的不断提高，活髓保存治疗在临床工作中较常见，活髓治疗后的牙髓组织能自我修复，其中需要修复相关的生长因子及蛋白参与。本研究就活髓保存治疗中修复相关生长因子及蛋白对牙髓损伤修复的作用作一综述。

牙髓损伤常因龋源性、机械性及外伤等导致，牙髓损伤后常使用优良的盖髓材料在近髓处或牙髓暴露表面覆盖并严密充填，降低牙髓的炎症反应及防止牙髓炎恶化，从而激发牙髓的反应性修复，即为活髓保存治疗。活髓保存治疗时，需减少外界环境对牙髓的刺激，牙髓损伤后可自身修复，修复时，许多细胞因子和蛋白在牙髓组织中表达并发挥重要的生理功能。研究表明，含有骨形态发生蛋白-2（Bone morphogenetie pro-tein-2，BMP-2）的明胶海绵在盖髓时能诱导修复性牙本质的形成，且在减少炎症反应方面展示出优异性能[1]；牙本质基质蛋白-1（Dentin matrix protein-1，DMP-1）在牙髓中过表达能诱导未分化间充质干细胞分化以及形成成牙本质细胞样细胞[2]；转化生长因子-β（TGF-β）能刺激牙髓-牙本质复合体细胞并介导牙髓修复过程[3]；牙本质涎蛋白（Dentin sialoprotein，DSP）在盖髓治疗时能诱导牙髓间充质细胞的增殖、分化、迁移，刺激牙髓血管化并参与牙本质的形成和矿化[4]；在盖髓术中牙本质磷蛋白（Dental phosphoprotein，DPP）能减少牙髓的炎症反应及促进修复性牙本质的形成[5]。以下介绍5 种与牙髓自我修复相关的生长因子及蛋白。

1 BMP-2

BMP 是TGF-β 超家族中重要的信号因子，不仅在牙齿发育中起着至关重要的作用，参与牙齿形成和组织修复，同时BMP 信号在分化成牙本质细胞的功能中也起重要作用，其作用是沉积和矿化牙本质基质[1]。BMP-2 在介导人牙髓干细胞（hDPSCs）增殖分化过程中，ERK/Smad 通路起到激活活化作用[6]。Parsegian[7]研究发现，原代牙髓（DP）在成牙本质细胞和成骨细胞分化过程中，BMP-2 和成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）对成牙本质细胞分化具有相互刺激的关系，而它们对成骨细胞分化的作用是独立介导的。其他学者也证实，iRoot BP Plus、BMP-2 都能提高人牙髓细胞（hDPCs）的增殖及成牙本质化的能力，然而，与单独使用iRoot BP Plus 或BMP-2 对比，iRoot BP Plus 与BMP-2 联合使用在诱导hDPCs 增殖、成牙本质分化方面更加高效[8]。在活髓保存的研究中，国内学者使用含有Nel-like molecule-1（NELL-1）和BMP-2 明胶海绵对大鼠上颌第一磨牙进行牙髓覆盖后，发现联合使用NELL-1和BMP-2 在诱导修复性牙本质形成和减少炎性细胞反应等方面显示出优异性能，而且联合使用可以显著调节牙髓修复[9]。同时，Souza 等[10]使用两种修复性生物材料盖髓并研究BMP-2 对牙髓矿化的作用时，qPCR 结果显示，与对照组及矿物三氧化物凝聚体（MTA）组相比，Biodentine（BD）组在30 天和60天时BMP-2 的表达显著增加，BMP-2 与矿化牙本质组织的形成有密切关系，因此BD 可以应用于牙髓手术中。另一位学者也证实，BMP-2 和TGF-β1 溶液分别与iRoot BP Plus 混合调匀用于盖髓术后能促进修复性牙本质的形成[11]。在进行活髓保存治疗时，BMP-2 对牙髓组织修复具有重要意义，同时，BMP-2与其他生物材料结合也能取得很好的效果，因此，可选择BMP-2 作为牙髓修复的参考因子。

2 DMP-1

DMP-1 是一种高度磷酸化的酸性非胶原蛋白，其在羟基磷灰石晶体生成以及矿化中起到调节作用。DMP-1 在牙髓多功能干细胞和未分化间充质干细胞中的过表达可以诱导这些细胞分化并形成功能性成牙本质细胞样细胞[2]。在牙齿发育的几个阶段中，DMP-1 作为细胞内及细胞外的信号分子介导成牙本质细胞的分化，研究发现DMP-1 缺失的小鼠可导致牙齿矿化不足[12]。在凋亡的环境中DMP-1 对成牙本质细胞和成釉细胞具有保护作用[13]。DMP-1介导细胞分化及矿化的通路中，其是通过激活丝裂原活化蛋白激酶-细胞外调节蛋白激酶（MAPKERK）通路激活干细胞的增殖分化，并且对成牙本质细胞及成骨细胞矿化具有促进作用[14]。研究发现，牙髓损伤修复过程中，DMP-1 沿着原发性牙本质和新形成的牙本质之间的边界沉积，其表达先于巢蛋白免疫反应细胞，并激活细胞的增殖及新基质的形成，表明DMP-1 是牙髓修复的触发因素[15]。Yamada 等[16]使用氢氧化钙（CH）、MTA、MTA 和富血小板血浆（MTA+PRP）对大鼠上颌第一磨牙进行直接盖髓，组织学上发现用MTA 和MTA+PRP 填充7 天和14 天后，观察到在嗜酸性牙本质桥（DB）或类骨牙本质（OD）中DMP-1 呈阳性，并且DMP-1阳性颗粒基质最终沉积在DB 和OD 的牙本质管中，这些发现表明MTA 和MTA+PRP 可能通过相关生长因子诱导未分化间充质细胞向成牙本质细胞分化。同时，有学者使用不同盖髓材料对人乳牙进行活髓切断术后，研究DMP-1 的免疫定位时发现MTA 组和硅酸盐水泥（PC）组中存在牙髓修复，没有炎症，并且形成硬组织屏障，免疫组化发现MTA 组与PC 组中DMP-1 在根部的牙本质以及在新形成的硬组织屏障小管中有相似表达[17]，说明DMP-1 参与了牙髓修复过程。在活髓保存时良好的盖髓剂盖髓并严密充填后，在良好的封闭环境中，DMP-1 可在牙髓覆盖部位和牙髓组织中作为修复相关的信号因子，诱导牙髓干细胞分化以及修复性牙本质的形成，同时，被诱导分化后的细胞具有再生牙本质样组织的潜力，也可能形成功能、结构、生理上与牙本质类似的组织，因此DMP-1 可以作为修复相关的因子参与牙髓损伤修复过程。

3 TGF-β

TGF-β 有3 种相似的亚型（TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3），调节相关细胞的增殖、分化、趋化和凋亡[18]。TGF-β 超家族生长因子具有广泛的生物活性，在牙齿及颅面骨的发育、形成和疾病中具有重要意义，其中TGF-β1 参与成牙本质细胞分化以及牙本质的矿化[19]。TGF-β 超家族信号传导中有两个分支，其中TGF-β 分支，如TGF-βs 主要磷酸化和激活Smad2 和Smad3，而另一个分支BMP 分支，其主要激活Smad1、Smad5 和Smad8[20]。Li 等[21]研发一种能持续释放TGF-β1 微球的壳聚糖双层膜材料，并用于犬齿的盖髓术中，60 天后发现未盖髓组中未形成修复性牙本质桥，不含TGF 壳聚糖双层膜组及Dycal 组形成不规则的修复性牙本质，而含有转化生长因子-β1（MS-TGF）微球壳聚糖双层膜组形成具有牙本质小管的实质性修复性牙本质，其厚度为（142±29）μm，是不含TGF 壳聚糖双层膜组及Dycal 组厚度的3～6 倍。国外学者使用自体牙髓干细胞（DPSCs）和MTA 对暴露犬牙进行盖髓的研究中，发现MTA 能诱导牙髓盖髓处形成了一个几乎完整的钙化桥，DPSCs 组中6 周时受损牙髓能修复再生，伴有矿化及钙化物的沉积，12 周时矿化的牙本质周围排列着一层清晰的成牙本质细胞并突向小管以及正常的牙髓组织中，并且DPSCs 组中TGF-β1 的表达明显强于MTA 组，说明DPSCs 在牙本质的修复和再生过程中具有更大的能力。这些研究表明，TGF-β1 在刺激牙髓-牙本质复合体细胞和介导牙髓修复过程中发挥重要作用[3]。另一项研究中，在大鼠上颌第一磨牙牙髓暴露后并用氢氧化钙（CH）和MTA 进行盖髓，另一组未进行任何处理，与未处理的对照组比较，发现CH 和MTA组下调了肿瘤坏死因子-α 表达，上调了TGF-β的表达[22]。牙髓损伤修复的过程中机制复杂，存在许多因子以及相关信号通路的参与，研究发现，TGF-β1 可以通过激活蛋白激酶B（AKT）、细胞外信号调节激酶1/2（Erk1/2）和p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38）MAPK 信号通路，促进牙髓干细胞在早期向成牙本质细胞分化[23]。在龋齿以及因其他原因引起的牙髓损伤中，TGF-β1 作为一种重要的生长因子参与并影响成牙本质细胞分化和钙化物沉积的自我修复过程，因此我们在研究中可以选择TGF-β1 作为活髓治疗后牙髓损伤修复过程中钙化物形成的指标之一。

4 DSP

牙本质发育与形成过程中，成牙本质细胞分泌并合成相关的非胶原蛋白进入牙本质细胞外基质中，DSP 和牙本质磷蛋白（DPP）是主要的两种牙本质非胶原细胞外基质，来源于牙本质涎磷蛋白（DSPP）。DSP 可以通过调节靶基因表达，参与细胞增殖分化以及牙本质的形成和矿化，在盖髓治疗时，DSP 诱导牙髓间充质细胞的分化、迁移并刺激牙髓血管化，说明DSP 具有作为牙髓-牙本质复合体再生剂的潜力[4]。制备窝洞或牙髓暴露等因素引起的牙髓损伤后，新分化形成的或者原存留的成牙本质细胞样细胞表达DSP 并参与修复性牙本质的免疫反应，同时在小鼠的免疫组织化学及原位杂交研究中发现，DSP 蛋白及mRNA 水平表达增加与成牙本质细胞分化的过程相一致[24]。与DSP 相关的盖髓研究中，张莹等[25]使用人牙本质涎蛋白（hDSP）对狗牙进行盖髓，结果发现术后8 周hDSP 组完整的骨样牙本质桥下方成牙本质细胞样细胞排列整齐，因此，hDSP 可以诱导牙髓细胞的分化以及修复性牙本质的形成。Fransson 等[26]研究发现EMDgel盖髓处有增生的牙髓附着，同时EMDgel 或氢氧化钙盖髓后新形成的硬组织中含有DSP 和胶原蛋白I（Col I）表达，可以认为DSP 和Col I 是牙本质形成的标志物。同时，国内学者用含有Matrilin-4 的胶原蛋白海绵进行盖髓研究，发现在第7 天时可见穿髓孔下有前期牙本质的形成，28 天时可见厚而完整的修复性牙本质形成，而且新形成的修复性牙本质下可见重组的成牙本质细胞层，免疫组化中DSP 在3～14 天时表达逐渐增强，28 天时表达减弱[27]。DSP参与牙髓损伤修复的过程以及机制尤为复杂，过程中存在信号通路的传导以及信号因子的表达，DSP作为一种配体，通过其细胞膜受体、整合素β6 和Ocln 促进细胞内信号传导，并诱导牙髓间充质干细胞分化和矿化[28]。

5 DPP

DPP 是DSPP 的另一个产物，由于其氨基酸结构中存在大量的天冬氨酸和磷酸丝氨酸，说明其带有酸性和阴离子性，能与Ca2+结合，因此DPP 能促进和调节羟基磷灰石晶体形成和沉积[29]。国外学者研究人DPP 衍生的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）肽对hDPSCs 增殖、分化和矿化的影响，结果发现3 种RGD 均能促进hDPSCs 的增殖，与RGD-1、RGD-2 组相比，RGD-3 能显著提高碱性磷酸酶（ALP）的活性，并且DMP-1、DSPP、ALP、骨涎蛋白（BSP）的mRNA 表达更显著，总之，人DPP 衍生的RGD 肽RGD-1、RGD-2 和RGD-3 在体外促进hDPSCs 的增殖、分化和矿化。在这3 种肽中，RGD-3 的作用最为显著。RGD-3 与hDPSCs 表面的整合素受体结合，并通过激活MAPK 通路的p38调节成牙基因的表达和分化[30]。在盖髓术中，有学者使用DPP 对小型猪恒牙进行盖髓，结果显示，2 周后牙髓细胞在形成的修复性牙本质周围发育成成牙本质细胞，1 个月后修复性牙本质桥完成，3 个月后牙本质桥变得致密而厚实，且主要为管状牙本质，这项研究表明DPP 不仅对牙髓刺激小，而且能诱导牙髓细胞向成牙本质细胞发育并形成牙本质桥[31]。使用含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）基序的DPP 肽和CH 对大鼠进行盖髓后，组织学上发现在第4 周时，与CH 组形成的有孔隙和粗糙的修复牙本质相比，RGD 组则诱导形成密集而致密的修复性牙本质，且形成率高于CH 组，牙髓的炎症状态也低于CH 组[32]。同时另有研究也证实，中等剂量的磷酸磷蛋白（PP）和重组DSP/磷酸磷脂（也称重组牙本质涎磷蛋白，recDSP/PP）盖髓后能减轻牙髓炎症，并促进修复性牙本质的形成[5]。然而，DPP 在牙髓干细胞分化以及牙髓组织修复过程中也有信号因子以及相关通路的传导，有学者研究发现DPP 激活NF-κB 后，启动信号级联反应，从而促进DPSCs 的牙源性分化[33]。

6 总结与展望

活髓保存治疗的成功需要及时控制感染的牙髓以及阻断牙髓炎症的恶化，采用生物材料保护牙髓，刺激牙髓进行自我修复，并严密充填形成良好的密闭环境。活髓保存的生物学基础是牙髓中有自我更新及具有分化能力的干细胞，当牙髓受到外部因素刺激时，这些细胞可能分化为成牙本质细胞样细胞参与牙髓损伤的修复过程。牙髓损伤修复是个生理机制尤为复杂的过程，在这个过程中存在多种机制的参与，许多生长因子及蛋白的表达，如上述的BMP-2、DMP-1、TGF-β、DSP、DPP 等在牙髓损伤修复过程中至关重要。虽然国内外学者对牙髓损伤修复进行了相关研究并有了一定的进展，但是相关的作用机制并不十分清晰，今后还需要进一步的研究和讨论。