葡萄籽中原花青素提取工艺优化

崔长伟，马彤彤*，束廷廷，李洋，张梦婷，王艳君

楚雄师范学院资源环境与化学学院（楚雄 675000）

葡萄作为世界上产量最大、种植面积最广的水果之一，葡萄种植主要以欧洲种（Vtis vinifera）和美国种（Vitis labrusca）为主，我国葡萄产量丰富，年鲜果产量可达千万吨。葡萄在加工时会产生葡萄籽副产物，葡萄籽一般用作饲料、肥料，其中含有的多种物质未被利用，葡萄酒生产会产生大量废弃物，如处理不当，会造成环境污染和资源浪费。在葡萄籽中，原花青素含量在5%～8%之内，原花青素是一种多酚化合物，由不同数量的（+）-儿茶素[（+）-catechin]和表儿茶素[（-）-Epicatechin][1]*单体缩合而成的聚合物[2]*，其抗氧化功效是维生素C的20倍、维生素E的50倍，具有抗辐射、抗肿瘤、抗衰老、治疗心血管疾病、提高免疫功能、预防神经退行性改变等作用[3-5]*。

原花青素的亲水性较好，易溶于多种有机溶剂中，如甲醇、乙醇、丙酮等。越来越多的科学家对原花青素的提取进行探究，他们对各种各样植物中的原花青素进行提取，将其利用在其他产品中。原花青素的提取方法主要包括溶剂提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法、超声-微波协同提取法、超临界CO2提取法及酶辅助提取法，这些方法各有优缺点，根据实际条件选用合适的提取方法，或将几种方法配合使用，以达到最佳提取效果[7]*。王文君等[7]*利用索氏提取法、热回流法、超声波提取法提取紫番薯原花青素，其中超声波提取法提取效果好。李俊儒等[8]*对比有机溶剂提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法和酶提取法在提取条件和提取率等方面的异同。

结合试验条件，有机溶剂提取法、超声波提取法、酶提取法进行试验可行性较高。方法相互结合的试验也有研究，但是几种方法同时对比的研究较少。俞腾飞等[9]*对葡萄籽采用纤维素酶-超声波辅助法提取原花青素的工艺研究，并且与超声波提取法形成对比，但是该试验存在一定局限性，其并未探究其他结合的方法。鉴于此，开展单一方法及复合方法提取原花青素的对比试验，综合考虑试验成本、试验环境、提取效果等，选择理想的试验方法。结合单因素试验和正交试验，得出葡萄籽原花青素提取的最佳工艺条件，以期提高产业的综合加工能力和原料利用率，改善环境，实现变废为宝，带动农产品发展。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器及试剂

1.1.1 试验材料

紫葡萄籽（新疆市售）。

1.1.2 仪器与设备

电子分析天平[SQP，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；电热鼓风干燥箱（DHG-9070A，上海一恒科学仪器有限公司）；超微粉碎机（800Y，武义海纳电器有限公司）；循环水式多用真空泵（SHZ-DⅢ，上海力辰邦西仪器科技有限公司）；超声波清洗器（SK8210HP，上海科导超声仪器有限公司）；恒温水浴锅（HWS-26，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；紫外可见分光光度计（UV-5500，上海元析仪器有限公司）；酸度计[Sartorius PB-10，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]。

1.1.3 主要分析试剂

石油醚（沸程30～60 ℃，天津市富宇精细化工有限公司）；正丁醇（含量≥99.5%，天津市大茂化学试剂厂）；六水合硫酸铁（Ⅱ）铵（硫酸亚铁铵，含量≥99.5%，汕头市西陇化工有限公司）；无水乙醇（含量≥99.7%，成都市科隆化学品有限公司）；盐酸（含量36.0%～38.0%，成都市科龙化工试剂厂）；三氯化铁（含量≥99.00%，重庆吉元化学有限公司）；柠檬酸（含量≥99.5%，天津市大茂化学试剂厂）；磷酸氢二钠（含量≥99.00%，天津市凤船化学试剂有限公司）；原花青素标准品（纯度≥95%，北京索莱宝科技有限公司）。试验所用试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程图

工艺流程如图1所示，葡萄籽中提取原花色素研究成熟完善的工艺为超声波提取法、有机溶剂提取法、酶提取法3种，但是各种方法结合文献分析各有其缺点，此次试验通过葡萄籽原料的预处理、催化剂的选择等将3种方法两两结合进行优势互补，从而结合正交试验的结果，从提取率、成本投入、环保等角度进行评价，从而筛选更有利于葡萄籽中原花色素的提取工艺方法。

图1 原花青素提取工艺流程图

1.2.2 葡萄籽的预处理

将市售葡萄籽在鼓风烘干箱中烘至恒重，使用粉碎机进行葡萄籽的破碎，并用0.425 mm孔径（40目）筛进行筛选，将过筛的葡萄籽粉使用石油醚进行脱脂，其比例1∶4，在0 ℃下脱脂48 h，脱脂结束使用真空泵进行抽滤，抽滤结束后在鼓风烘干箱中将葡萄籽粉烘至恒重。

1.2.3 催化剂选择

采用超声波提取法、有机溶剂提取法、酶提取法的工艺，分别使用硫酸亚铁铵和三氯化铁作为催化剂，根据其提取率，研究催化剂对于葡萄籽中原花青素提取的影响。

1.2.4 标准曲线的绘制

按郗艳丽等[10]*方法稍作修改。

精密称取10 mg原花青素标准品，放在10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶解且定容至刻度，摇匀，得质量浓度为1.0 mg/mL的原花青素标准品，分别取0，0.05，0.1，0.15，0.2和0.25 mL标准品置于25 mL比色管中，加入50%乙醇至1 mL，加入6.0 mL的正丁醇-盐酸溶液（体积比为95∶5）和0.2 mL 2%硫酸亚铁铵溶液（2 mol/L的盐酸溶液溶解），摇匀并用正丁醇定容至10 mL，沸水浴加热40 min，显色后立即使用冰水冷却20 min，在550 nm处比色测定。

1.2.5 原花青素提取率的计算

取1 mL粗提取液进行稀释定容，然后进行原花青素含量的测定，根据式（1）计算原花青素提取率[11]*。

原花青素提取率=c×m×v/（1 000×ω） （1）式中：c为回归方程得到的质量浓度，mg/mL；m为稀释倍数，v为待测液体积，mL；ω为称取葡萄籽质量，g。

1.2.6 提取方法探究

1.2.6.1 超声波辅助酶提取法

称取2.000 g脱脂葡萄籽粉放在锥形瓶中，按照料液比1∶20 g/mL、乙醇体积分数70%，使用缓冲液调节pH 4.0，加入100 U/mg 0.4%的纤维素酶，在45 ℃、超声功率200 W条件下，超声10 min，酶解1.0 h后，抽滤后，对粗提取液进行稀释定容，待用。按照1.2.4及1.2.5小节进行原花青素含量的测定并计算提取率。

1.2.6.2 超声波辅助有机溶剂提取法

称取2.000 g泡过石油醚的葡萄籽粉放在锥形瓶中，据料液比1∶20 g/mL、乙醇体积分数70%，在45 ℃，使用超声波清洗机，其功率200 W，时间10 min，在水浴锅提取54 min后，抽滤后，对粗提取液进行稀释定容，待用。按照1.2.4及1.2.5小节进行原花青素含量的测定及提取率的计算。

1.2.6.3 酶辅助有机溶剂提取法

称取2.000 g脱脂葡萄籽粉放置于锥形瓶中，在料液比1∶20 g/mL、乙醇体积分数70%情况下，使用缓冲液调节pH 4.0，加入100 U/mg 0.4%的纤维素酶，在提取温度55 ℃情况下，提取54 min，抽滤后，对粗提取液进行稀释定容，待用。按照1.2.4及1.2.5小节进行原花青素含量的测定及提取率的计算。

1.2.7 单因素试验

1.2.7.1 加酶量对原花青素提取率的影响

按照料液比1∶20 g/mL、乙醇体积分数70%，使用缓冲液调节pH 4.0，在温度45 ℃、超声功率200 W条件下，超声10 min，酶解1.0 h后，探究加酶量（0.8%，1.0%，1.2%，1.4%和1.6%）对原花青素提取率的影响。

1.2.7.2 超声功率对原花青素提取率的影响

按照料液比1∶20 g/mL、乙醇体积分数70%，使用缓冲液调节pH 4.0，加入100 U/mg 0.4%的纤维素酶，在45 ℃温度下，超声10 min，酶解1.0 h后，探究超声功率（200，250，300，350和400 W）对原花青素提取率的影响。

1.2.7.3 超声时间对原花青素提取率的影响

按照料液比1∶20 g/mL、乙醇体积分数70%，使用缓冲液调节pH 4.0，加入100 U/mg 0.4%的纤维素酶，在温度45 ℃、超声功率200 W条件下，酶解1.0 h后，探究超声时间（10，20，30，40和50 min）对原花青素提取率的影响。

1.2.7.4 料液比对原花青素提取率的影响

按照乙醇体积分数70%，使用缓冲液调节pH 4.0，加入100 U/mg 0.4%的纤维素酶，在温度45 ℃、超声功率200 W情况下，超声10 min，酶解1.0 h后，探究料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40和1∶50 g/mL）对原花青素提取率的影响。

1.2.8 正交试验

据单因素试验结果，设计正交试验，并进行平行试验，测定原花青素含量，进行计算分析。

表1 正交因素水平表

1.2.9 验证试验

通过正交试验进行极差分析与方差分析，经过验证确定出提取原花青素的最优工艺。

1.2.10 数据处理

试验运用Excel 2016，SPSS 26.0进行试验数据的汇总与统计分析。

2 结果与分析

2.1 催化剂选择

根据图2，通过3种提取方法发现硫酸亚铁铵溶液作为催化剂的提取率比三氯化铁溶液硫酸亚铁铵溶液要高，因此硫酸亚铁铵溶液的显色效果比三氯化铁溶液的显色效果好。一定量的过渡金属离子如Mn2+*、Cu2+*、Fe2+*、Fe3+*等能促进反应的进行，但过量的醌类及Mn2+*、Cu2+*会降低吸光度，采用3价铁盐较为适合，如硫酸亚铁铵[14]*。因此选择硫酸亚铁铵溶液作为显色剂。

图2 原花青素提取催化剂的选择

2.2 标准曲线

根据1.2.4小节的试验方法，绘制原花青素标准曲线。绘制标准曲线得到回归方程y=1.191 4x+0.040 9（x为原花青素标准品浓度，mg/mL；y为吸光度），R2*=0.999 6，接近于1，表明原花青素标准品浓度与吸光度有良好线性关系，该方程具有可靠性。

图3 原花青素标准曲线

2.3 提取方法探究结果分析

2.3.1 研究葡萄籽中原花青素的提取方法

2.3.1.1 研究单一方法提取葡萄籽中原花青素

单一方法提取葡萄籽中原花青素的浓度与提取率结果见表2。

表2 单一方法提取葡萄籽中原花青素的浓度与提取率

2.3.1.2 研究复合方法提取葡萄籽中原花青素

为探究提取原花青素更优的试验方法，在3种单一试验方法的基础上将其进行方法融合，进行优势互补，且3种复合方法与最好单一方法存在显著性差异（P＜0.05），原花青素提取率顺序为酶辅助有机溶剂提取法＞超声波辅助酶提取法＞超声波辅助有机溶剂提取法＞超声波提取法。虽然酶-有机溶剂提取法提取效果比超声波-有机溶剂提取法好，但其时间长，有机溶剂易挥发，导致有机溶剂含量减少，造成的试验误差大。而超声波辅助酶提取法，其操作方便，用时相对短，提取效果相对超声波辅助有机溶剂提取法来说较好。复合方法提取葡萄籽中原花青素的浓度与提取率结果见表3。

表3 复合方法提取葡萄籽中原花青素的浓度与提取率

2.4 单因素试验

2.4.1 超声时间对原花青素提取率的影响

由图4可知，在10～20 min，随着超声时间延长，原花青素提取率不断上升，在20 min后，略有降低，其变动起伏不大，可能是系统误差造成的，30～40 min时出现明显上升，随着超声时间延长至50 min，提取率呈下降趋势，此时提取率下降与原花青素的稳定性有关，随着超声时间的延长，原花青素的氧化程度增高，导致其提取量下降[16]*，从而导致原花青素提取率降低，故原花青素提取时最佳超声时间为40 min。

图4 超声时间对原花青素提取率的影响

2.4.2 超声功率对原花青素提取率的影响

由图5可知，在200～250 W间超声功率变大时原花青素浸提率上升，在250 W时提取率最高，250 W后提取率下降并在300 W后维持基本不变。超声清洗机功率变大，有物质溶出，与提取物质反应，导致其降低。故原花青素提取的最适合的超声功率为250 W。

图5 超声功率对原花青素提取率的影响

2.4.3 加酶量对原花青素提取率的影响

由图6可知，初始随着加酶量增加，原花青素提取率缓慢上升，当加酶量增加至1.2%～1.4%时，原花青素提取率明显上升，说明纤维素酶浓度增大，植物细胞壁被破坏的作用变大；酶解完全后，加酶量继续增大，溶液不饱和，酶解效果不佳，因此提取率降低。故原花青素提取时最佳加酶量为1.4%。

图6 加酶量对原花青素提取率的影响

2.4.4 料液比对原花青素提取率的影响

由图7可知，料液比1∶10 g/mL的提取率明显高于1∶20 g/mL，这是因为乙醇溶液与葡萄籽粉相互混合，其浓度较高，提取过程中乙醇具有挥发性，溶剂降低，溶质不变，导致提取率高，料液比1∶30 g/mL时提取率最高，随后呈下降趋势，并趋于平缓。在一定范围内，提取剂量越大，原花青素提取量越大，但提取剂量过大时反而会影响纤维素酶的催化作用，导致原花青素提取量下降[17]*，故原花青素提取时最佳料液比为1∶30 g/mL。

图7 料液比对原花青素提取率的影响

2.5 正交试验

通过上述试验，选择对葡萄籽中原花青素浸提率影响较明显的4个因素（超声功率、超声时间、料液比、加酶量），选择其最优的3个水平进行正交试验。

根据表4，通过极差分析，各因素的顺序为C＞B＞A＞D，由此可得出，影响葡萄籽中原花青素提取率的4个因素先后顺序为料液比＞超声时间＞超声功率＞加酶量，最佳提取工艺是A2B3C3D1或A3B3C3D1。

表4 L9(34*)正交试验优化葡萄籽中原花青素的提取

2.5.1 方差分析

由表5可知，R2*=0.934（调整后R2*=0.926），其越接近1，试验越具有可靠性，并且试验误差均方为0.002，误差小，该试验具有可行性。经F检验，A、B、C、D这4个单因素都对原花青素提取率的影响极显著。

表5 正交试验方差分析结果

2.5.2 验证试验

A2B3C3D1的平均提取率为1.62%，A3B3C3D1的平均提取率为1.38%，P＜0.05，两者存在显著差异，因此，最佳的提取工艺为A2B3C3D1，即超声功率250 W、超声时间45 min、料液比1∶35 g/mL、加酶量1.3%、乙醇体积分数60%、酶解温度50 ℃。

3 结论

通过对比单一方法与复合方法，复合方法的提取率要比单一方法提取率高，并且结合试验环境、试验成本、提取率，选择超声波辅助酶提取法提取原花青素，试验时间短，可节约试验成本，提取率较高。由正交试验可知：影响葡萄籽中原花青素提取率的4个因素先后顺序为料液比＞超声时间＞超声功率＞加酶量，最佳提取工艺为A2B3C3D1，即超声功率250 W、超声时间45 min、料液比1∶35 g/mL、加酶量1.3%、乙醇体积分数60%、酶解温度50 ℃。进行验证试验，试验平行3次求得平均值，原花青素的平均提取率为1.62%，比正交表中最佳提取率提高0.25%。葡萄酒厂废弃的葡萄籽含有丰富的可利用资源，可用于提取酚类物质，并开发产业副产品，通过这种方法解决葡萄籽的再利用问题，对葡萄籽的综合利用具有一定指导意义。