小檗碱及其衍生物的抗肥胖作用

邱方泓,张桂菊

(1.山东中医药大学,山东 济南 250355;2.山东中医药大学附属医院,山东 济南 250014)

在过去的几十年里,肥胖逐渐成为严重的全球公共卫生问题,因其独特的隐匿性与慢性致病,肥胖常常与哮喘、2型糖尿病、心脏疾病[1]、代谢综合征等疾病伴生,是多重疾病的危险因素[2]。肥胖患者常伴有呼吸功能障碍和免疫功能障碍,加剧了患肺炎时产生严重并发症甚至死亡的风险[3]。

黄连为毛茛科植物黄连、三角叶黄连或云连的干燥根茎。药典中记载,黄连具有清热燥湿,泻火解毒的功效,常用于治疗腹泻等疾病[4]。小檗碱(BBR)是一种从黄连等草本植物中提取的异喹啉类生物碱化合物,通过单磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)等信号通路,发挥抗癌、调节糖脂代谢等作用。近些年研究发现,BBR具有一定程度的抗肥胖作用,可以诱导白色脂肪细胞向棕色脂肪细胞转化[5]、提高机体的基础代谢率、促进脂肪细胞及骨骼肌细胞线粒体生成等,被认为是治疗肥胖[6]、2型糖尿病[7]、神经退行性疾病[8]、心血管疾病[9]等多种代谢相关疾病的潜在药物。然而BBR的生物利用率很低,阻碍了临床应用。研究人员设计了多种BBR衍生物,提高了BBR的药理活性,又引入纳米技术等先进科技,这些措施显著提高了BBR的肠道吸收率和溶解度。

本文主要介绍了BBR在脂肪细胞增殖、分化及脂质积累等方面做出的贡献以及相关毒理学,并介绍了新兴BBR相关衍生物,以帮助临床应用参考。

1 小檗碱的毒理学和药代动力学

1.1 药代动力学由于肠道中的首过代谢效应、肠道通透性差、自聚集、P-糖蛋白介导的外排和肝胆再排泄等因素,BBR的口服生物利用度非常低。胃内给药后,大鼠胃内36小时内被吸收的BBR的比例最多占总剂量的44%[10],BBR肠上皮细胞吸收率不到10%[11],仅0.5%的BBR剂量可以进入门静脉[12]。在大鼠胃内给药(200 mg·kg-1)48 h中,BBR广泛分布在肝脏、肾脏、肌肉、肺、脑、心脏、胰腺和脂肪,其中肝脏为主要分布器官,肝脏内的BBR平均浓度约为血浆浓度的70倍[13]。在脂肪组织中,BBR将在2 h内达到最大浓度[13],但是口服BBR后脂肪组织内浓度非常低,约0.4 ng·g-1。目前尚未能在脂肪组织中检测到BBR代谢产物[13]。在大鼠体内,BBR可以代谢成97种代谢物,主要代谢器官为肠道和肝脏,BBR在肠道中主要发生包括氧化去甲基化(生成M1)和葡萄糖醛酸化代谢[10],在肝脏中主要发生Ⅰ期去甲基化和Ⅱ期葡萄糖醛酸化代谢[14]。BBR的代谢产物广泛分布于肝脏、肾脏、肺、肌肉、心脏和胰腺[10,13],以肝脏为主,肝脏中的代谢物以Ⅰ期代谢物为主,特别是M1和M2[13]。BBR主要经由粪便、尿液和胆汁排泄,实验证明,约有22.74%的BBR从粪便中排泄,约0.09%经胆汁和尿液排泄[15],肌肉、器官和胃肠内容物中残留BBR(包括主要代谢物 M1 和 M2)约为2.7%[15]。另有研究表明,BBR及其九种代谢物从尿液、胆汁和粪便中的总回收率为 41.2%[16]。总回收率低的原因可能有大量的BBR未被排泄或未被检测出,也可能是存在尚未被发现的代谢产物。

1.2 毒理学目前批准上市的减肥药具有很好的治疗肥胖的作用,但也存在不同程度的不良反应和副作用[17],新兴的膳食补充剂在安全性和有效性上也同样存在争议[18]。近些年人们的减肥热情日益高涨,在减肥药的使用上也更加大胆,BBR被认为是治疗肥胖及其并发症的潜在药物[6]得到了广泛的关注,其安全性更需要明确的毒理实验来验证。

Jun等[19]测定了黄连生物碱(包括BBR、黄连碱、巴马汀和表小檗碱)的细胞毒性,认为黄连生物碱均存在剂量依赖性细胞毒性(低浓度时表现为极低的细胞毒性),在3T3-L1细胞中,BBR的IC50值为41.76 μg·mL-1,在急性毒性试验中,毒性等级为第三等级(微毒)。因为BBR的口服吸收率很差,口服给药很难达到具有毒性作用的浓度。Hu等[20]的实验同样支持这种观点,同时他们还证明了BBR对小鼠肾脏、脾脏等器官以及白色脂肪组织无毒性作用。值得注意的是,一项对3T3-L1前脂肪细胞活力测定证明了令BBR对脂肪细胞发挥作用的是BBR本身抑制脂质积累和脂肪细胞的分化的能力,而不是其细胞毒性[21]。这都表明BBR具有良好的抗肥胖潜力和安全性。

2 小檗碱对前脂肪细胞的影响

脂肪器官由脂肪细胞、处于不同发育阶段的前脂肪细胞、成纤维细胞、间充质干细胞、巨噬细胞、基质细胞、血管及神经等组成[22-23]。脂肪细胞主要分为3种,包括白色脂肪细胞、棕色脂肪细胞及米色脂肪细胞,他们组成了两种主要类型的仓库:白色脂肪组织(WAT)与棕色脂肪组织(BAT),这些仓库具有不同的分布区域及功能[24],每个仓库都有独立的血管和神经供应。白色脂肪细胞由单个脂滴和细胞核组成,棕色脂肪细胞具有多房脂滴及大量的线粒体[25],棕色脂肪组织(BAT)通过非耦合呼吸将食物中的化学能转化为热量。当受到冷暴露等刺激时,白色脂肪细胞会转化为米色脂肪细胞以促进产热,这种现象被称之为“褐变”,米色脂肪细胞的数量显著增加,同时Ucp1水平和线粒体生物合成增加。同样的,当饮食摄入过量时,前脂肪细胞可以直接发育为白色脂肪细胞,棕色脂肪细胞也可转化为白色脂肪细胞,这种脂肪细胞的可塑性,保证了哺乳动物适应环境改变的能力。

脂肪生成是一个复杂的过程,有报道称,脂肪细胞的平均半衰期约为8.3年[26],新生成的脂肪细胞不断代替凋亡的脂肪细胞以维持脂肪组织细胞数量的动态平衡。在终末分化为成熟脂肪细胞之前,脂肪衍生干细胞失去向其他细胞类型(如骨细胞、肌细胞)分化的能力,转化成前脂肪细胞[27]。前脂肪细胞具有增殖和向脂肪细胞分化能力,是一种特异性前体细胞,占成人脂肪组织中细胞的15%到50%[28]。前脂肪细胞存在于整个成年期,不同脂肪库的前脂肪细胞具有特异性[29],促进前脂肪细胞定型和成熟的机制涉及多种蛋白质因子调节因子、表观遗传因子和miRNA[28]。研究发现,前脂肪细胞具有分泌、免疫和分化功能,通过分泌趋化因子、炎症性脂肪因子参与免疫调节,诱导血管生成,通过DNA的甲基化、去甲基化及组蛋白修饰来控制脂肪细胞分化[30]等。脂肪细胞的过度分化、增殖和体积异常增长是导致肥胖的重要原因。近些年研究表明,BBR可以直接调节前脂肪细胞的增殖和肥大,具有促进人类和小鼠前脂肪细胞向棕色脂肪细胞分化的作用[31]。

2.1 小檗碱双向调节前脂肪细胞的增殖Xie等[32]发现在48 h节点及72 h节点,浓度范围为2.5～10 μmol的BBR可以促进3T3-L1前脂肪细胞增殖,当浓度继续增加时,BBR表现出抑制前脂肪细胞增殖的作用,说明BBR以浓度和时间依赖性调节T3-L1前脂肪细胞的增殖。Liu等[33]的实验也证明了这个观点,同时他们还指出用 10 μmol·L-1BBR处理的前脂肪细胞显示细胞质中的脂滴明显减少。

BBR调节3T3-L1前脂肪细胞增殖的机制尚不明确,但我们可以从BBR对其他具备异常增殖细胞的作用机制中得到一些启示。通过对脂肪细胞更为深入的研究,有研究人员认为,脂肪细胞具有一定的“癌症特征”[34-35],它们都可以维持增殖信号、诱导血管生成、具有代谢和内分泌能力、DNA的氧化应激损伤和对其他器官和组织的破坏性浸润等[36]。Dana等[37-38]于体外成功将乳腺癌细胞转化为典型的脂肪细胞,这是一种利用细胞可塑性将恶性细胞转化为良性表型的新方法,也间接证明了脂肪细胞与癌细胞的共性。鉴于两者的相似性,有理论认为,在生命之初,脂肪细胞可能起源于一些祖先的良性间充质遗传性肿瘤[34]。因此,BBR对癌细胞的作用有一定的参考意义。

BBR参与细胞凋亡、自噬以及细胞周期进程,IC50为3.436 mmoL·L-1[39],在1.0 μmol时阻滞细胞周期的G1期[40]。BBR可以通过与脂质代谢相关的信号通路抑制癌细胞的异常增殖,BBR通过SCAP/SREBP-1通路下调脂肪生成酶的表达并抑制从头生成脂肪,引起癌细胞中的Wnt/β-catenin信号通路失活和细胞周期停滞,并通过抑制mTOR依赖的HIF-1α蛋白合成来抑制癌细胞过度活跃的葡萄糖代谢[41]PI3K-AKT通路是经典的响应胰岛素信号的通路。BBR可以通过下调胰岛素样生长因子2(IGF2)mRNA结合蛋白3(IGF2BP3)、p-PI3K、p-Akt和 p-mTOR[40]等蛋白水平,抑制PI3K/AKT/m-TOR通路的活性,抑制细胞增殖和周期转换,诱导细胞的G1期阻滞[42]。对PI3K/AKT/m-TOR信号通路的抑制可以促进自噬水平,增加细胞周期的停滞。

2.2 小檗碱介导前脂肪细胞的分化3T3-L1前脂肪细胞在分化早期,CREB转录活性受到cAMP依赖性PKA催化的丝氨酸133(Ser133)磷酸化的刺激[43],增加C/EBPβ和C/EBPδ核转录因子的表达,触发复杂的转录级联,诱导PPARγ和C/EBPα的表达[44]。对小鼠和培养细胞的研究表明,PPARγ是脂肪细胞分化的必要条件和充分条件[45]。进而激活产生脂肪细胞表型的一组基因的转录上调,使前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞。

有研究表明,在3T3-L1前脂肪细胞分化的早期,BBR具有降低cAMP反应元件结合蛋白(CREB)磷酸化和C/EBPβ 表达的作用,抑制CREB活性使C/EBPβ触发的转录级联反应减少,从而阻断脂肪生成[46]。PPARγ靶基因(如aP2和DsbA-L)表达水平也被BBR明显下调[47],使PPARγ活性降低。

近些年,半乳糖凝集素-3(galectin-3,Gal-3)的配体半乳糖凝集素-3结合蛋白(galectin-3BP)被认为是肥胖与代谢综合征的新标志物[48]。Gal-3在肥胖人类和小鼠的血清中显著增加[49-50],该蛋白可以促进脂肪细胞分化的主要调节因子PPARγ以及(C/EBP)α和 C/EBPβ的表达和蛋白水平,参与脂肪细胞的分化[51]。BBR下调了人类和小鼠白色脂肪组织中Gal-3的表达[52],抑制前脂肪细胞向白色脂肪组织的分化和增殖,这个过程可能由AMPK信号通路介导[53]。

BBR可以通过增加依赖AMPK的3T3-L1细胞中的NAD+/NADH比率增强SIRT1的活性[54],也可以直接上调SIRT1蛋白水平和活性,以AMPK依赖性方式调节PPARγ去乙酰化水平[55]。在脂肪细胞中,SIRT1抑制剂减弱了BBR诱导的葡萄糖消耗和LKB1、AMPK和ACC磷酸化的增加,BBR通过SIRT1通路部分恢复了抑制的AKTSer473磷酸化,改善脂肪细胞中TNF-α诱导的胰岛素作用受损[55]。SIRT1作为一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)依赖性脱乙酰酶,对PPARγ和PRDM-16 进行去乙酰化和稳定化[56],有助于棕色前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞[57]。SIRT1也可以使丝氨酸/苏氨酸激酶肝激酶B1(LKB1)去乙酰化以激活AMPK[58]。SIRT1和AMPK的双向调节作用可以放大作用效果。

2.3 小檗碱促进棕色脂肪组织的生成与产热棕色脂肪组织主要靠非颤抖产热来对抗低体温,冷暴露导致交感神经系统(SNS)释放去甲肾上腺素并激活β3-肾上腺素能受体(ADRB3)诱导人类BAT产热。高脂饮食[59]和PPARγ[60],可以诱导前脂肪细胞向棕色脂肪细胞的分化。PPARγ和PKA激活UCP1启动子[61],激活棕色脂肪细胞的UCP1依赖性产热[62]。UCP1 是一种能够在寒冷中介导适应性非颤抖产热的蛋白质,受cAMP诱导的过氧化物酶体增殖物激活的辅激活因子1α(PGC1α)和PRDM16的调节[63],增加脂肪细胞特异性基因(aP2、PPARγ等)的表达。大量实验证明,BBR可以增加棕色脂肪的质量和活性,并通过AMPK等信号通路增加产热基因的表达。

BBR可以通过靶向线粒体,通过AMP/ATP比率的增加以及活性氧(ROS)的积累来增加AMPK活性,被认为是一种AMPK激活剂[64-65]。同时BBR显著上调棕色脂肪富集基因、脂肪酸β-氧化基因、成脂基因表达水平,增加UCP1和PRDM16的表达水平和蛋白质丰度,以及PPARγ、C/EBPα、AP2等脂肪形成标志物的表达水平[66]。PRDM16由棕色脂肪特异性表达[67],是棕色/米色脂肪生成的主要调节因子,可以驱动棕色脂肪的分化,BBR通过抑制Prdm16启动子的DNA甲基化来促进PRDM16的表达,以促进棕色脂肪生成,激活AMPK-α-KG-PRDM16轴,促进棕色脂肪产热[66]。同时BBR还可以AMPK-PGC1α轴,增加棕色脂肪活性,使肥胖db/db小鼠的能量消耗增加、增加线粒体含量,从而使耐寒性提高[68]。BBR在促进产热方面仍然具有前瞻性的治疗意义[5],但目前仍缺乏适当的临床试验来支撑这一结论。

2.4 小檗碱抑制3T3-L1前脂肪细胞的脂质积累多项研究表明BBR可以抑制3T3-L1前脂肪细胞中的脂滴积累和细胞活性,这种现象具有剂量和时间依赖性[69-70],较低剂量(5 μmol)的BBR明显减少了用ORO染色的脂滴数量[71]。Hao等[72]发现BBR可以增加小鼠3T3-L1前脂肪细胞脂解相关基因ATGL的表达、降低脂肪生成相关基因Srebp-1c、Fasn、Acc和Scd1的表达,来增加脂肪细胞的脂肪分解、抑制脂肪细胞脂质的生成。同时他们运用微波合成方法制成的BBR-黄芩素杂化化合物(BBS),这种化合物在减少脂质积累方面效果更好。BBR增加3T3-L1前脂肪细胞中HSL和ATGL的表达,这个过程可能受AMPK信号通路部分调节[73]。脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)和激素敏感性脂肪酶(HSL)是脂肪细胞TG代谢的限速酶,限制脂肪分解速率[74],HSL主要促进儿茶酚胺和利钠肽诱导的脂肪分解,ATGL主要参与介导甘油三酯的水解。甾醇调节元件结合蛋白(SREBP)是调节脂肪生成基因表达的主要转录因子,该蛋白靶向脂肪生成酶过度表达导致异常的脂质生成、持续的脂质积累和不受限制的细胞生长。BBR通过介导AMPK激活,诱导前体SREBP-1c磷酸化以抑制SREBP-1c的蛋白水解加工、核易位和靶DNA结合,进而减少了脂肪生成基因(如FAS、LPL、PPARγ、C/EBPα 和 ACC-1)的表达以及细胞的脂质积累[75]。除此之外,BBR具有直接降低Srebp1、SREBP2和下游基因Fas表达水平的能力,通过SREBP-1相关通路和UCP-1相关途径抑制脂肪和胆固醇生成[71]。

3 小檗碱对miRNA的调节作用

microRNA(miRNA)是细胞核中产生的短非编码RNA 分子(21-23 个核苷酸),可以通过与靶mRNA结合后调控机制介导代谢稳态,Francisco等[76]分析了723 个人皮下脂肪和脂肪细胞分化过程中的miRNA表达谱,有70种miRNA在脂肪细胞发育过程中出现差异性表达,其中前脂肪细胞中表达的miR-10a、miR-34a、miR-100与BMI相关,miRNA通过调节脂肪细胞增值分化的调节因子来控制脂肪细胞分化[77]。近年来,研究人员称BBR的抗癌、抗肥胖作用与miRNAs密切相关,将microRNAs(miRNAs)推测为BBR的推定靶标[78]。

在3T3-L1细胞中,miRNA-27a和miRNA-27b的表达水平被BBR明显上调,与BBR抑制3T3-L1细胞分化的能力呈正相关[69]。PPAR-γ是脂肪细胞分化的重要调节因子,在全身脂质和葡萄糖代谢中发挥作用。有研究称,miRNA-27a的抗分化活性可能是通过抑制PPAR-γ表达来实现的[79-80]。PPAR-γ也是miRNA-27b的直接靶标,miRNA-27b的表达水平的上调可以抑制PPARγ和C/EBPα的早期诱导,导致甘油三酯积累受损,并在终末分化时抑制脂肪形成标记基因的表达[82]。

BBR明显抑制大鼠外周血及肝细胞中miR-122的表达,进而抑制肝糖异生酶(包括PEPCK和G6Pase)、糖脂代谢蛋白(包括SREBP-1、FAS1和ACCα)的生成,通过抑制糖异生来改善高脂饮食大鼠的葡萄糖代谢[82]。

BBR增加了miR-10a-5p的表达,当与水苏糖联合治疗时提升幅度更大[83]。miR-10a-5p是调节脂肪细胞增殖分化的关键调节因子。有研究表明其通过靶向载脂蛋白L6(Apol6)[84]、Map2k6、Fasn基因[85],抑制3T3-L1细胞的分化和脂肪积累。过度表达的miR-10a-5p可以降低G1和G2期的细胞比例,并增加S期的细胞,促进小鼠前脂肪细胞的增殖。还可以显著降低脂肪形成标记基因 PPARγ、脂联素和aP2的蛋白质水平以及p-Akt(Ser473)的水平,抑制小鼠前脂肪细胞的成脂分化能力[85]。有报道称,miR-10a-5p很可能直接结合脂肪酸合酶(Fasn)的3′-UTR来靶向Fasn,来实现对前脂肪细胞成脂分化能力的抑制,Fasn的主要功能是在NADP(H)存在下催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A合成棕榈酸酯长链饱和脂肪酸[86],参与胆固醇的生物合成[87]。miR-10a-5p也可以靶向抑制Rora mRNA的表达,减少脂质积累和脂肪细胞标志物表达(包括Plin1),抑制脂肪生成,上调Ucp1、Dio2和Mki67的表达,促进米色脂肪细胞生成[88]。

4 BBR衍生物

基于纳米颗粒的药物递送系统的开发和应用改变了BBR的药物输送,提高了BBR的生物利用率。Mei等[89]以固体脂质纳米粒(SLNs)作为载体,制备负载BBR的SLN(BBR-SLN),增加了BBR的血浆浓度和生物利用度,同时他们还检查了BBR-SLN对db/db糖尿病小鼠肝脏脂质代谢的影响[90],认为BBR-SLN可以降低脂肪积累水平和脂肪生成基因的表达,在治疗肝脂肪变性方面具有良好的前景。Zhao等[91]从黄连提取物中分离的天然纳米颗粒(Nnps),制备Nnps-BBR复合物,该复合物改善了BBR在肠道内的吸收率和代谢稳定性。Thuan等[92]以脂质体作为纳米技术药物递送系统(DDS)的纳米制剂,8 h释放的BBR量约为75%,但负载的BBR部分从晶体形式变为无定形形式。Sahibzada等[93]通过反溶剂沉淀法将粒径减小到纳米范围制备BBR纳米颗粒,使兔肝功能测试酶水平和肝脏组织病理学显着改善,药代动力学参数(Cmax和曲线下面积)比未加工的BBR高约3.97倍和3.88倍。

除了纳米技术的应用,为提高其药理活性,设计了BBR衍生物,Chow等[94]制备了13-甲基BBR,该化合物可以抑制PPARγ 通路和激活AMP 活化蛋白激酶(AMPK)通路发挥比BBR更强的康肥胖作用,在细胞中,13-甲基BBR较BBR表现出更高的摄取和积累水平以及较低的细胞毒性。

5 期待与展望

脂肪组织的生成是一个复杂的过程,BBR作为肥胖的潜在治疗药物,机制可能是通过影响PI3K-AKT、Ucp1、AMPK、AMPK-PGC1α等通路影响着脂肪细胞基因的表达和蛋白丰度,介导前脂肪细胞的增殖、分化和脂质积累,这些作用通常具有时间和浓度依赖性。

在近些年的研究中发现,BBR对新发现的肥胖标志物,如Gal-3、miRNAs等同样发挥作用,BBR通过多靶点抑制脂肪组织的异常增殖,尽管BBR对肥胖的疗效已经受到广泛认可,但仍然需要更多更深入的研究来了解其机制。现如今,有许多药物(如SGLT 1/2抑制剂、AMPK/Sirt1激活剂)开发用于治疗肥胖症[95],BBR对能量稳态做出的贡献,或许能为新药的开发带来启示。

BBR的生物利用率低阻碍了BBR的临床应用。为解决这一难题,采用纳米技术等新兴技术促进BBR的溶解度与吸收度,设计BBR衍生物增强组织靶向性,提高BBR的抗肥胖作用。但令人担忧的是,BBR在吸收后有广泛的组织分布,特别是肝脏、肾脏,改变整个肠道上皮的运转特性以增强BBR的摄取可能会使有害物质更容易侵袭人体。需要进一步进行严格的科学研究与随机对照试验,全面评估BBR的安全性与临床疗效。

综上所述,尽管BBR及其衍生物在抗肥胖领域的益处是显而易见的,但还存在诸多不足,我们相信,随着对该化合物作用机制的不断深入研究,最终会为人类健康事业的发展做出贡献。