中国主要牧区特色干制发酵乳制品细菌多样性和游离氨基酸及脂肪酸特征性分析

刘振东，程秀峰，索朗群培，邢书源，李 梁，张金超，罗 章

（西藏农牧学院食品科学学院，西藏特色农产品研发中心，食品科学与工程重点实验室，西藏 林芝 860000）

发酵是古老的食品加工和保存方法之一，可以追溯到几千年前[1]。在食品发酵过程中微生物可以提高营养物质的生物利用度，增加防腐保质性能，丰富食品风味，提高食品安全性[2]。干制发酵乳制品既可以使奶类产品长时间保存和远距离运输，又能让乳糖不耐症患者更容易接受奶制品[3]。干制发酵乳制品独特的风味和营养特性由5 个因素共同决定：地理和气候条件、奶源、原料混合物变化、生产工艺和微生物[4]。在这些因素中，细菌对干制发酵乳制品的营养特性起着关键作用。

西藏、内蒙、新疆和云南4 个地区均有大量牧民存在，各种各样的乳制品是牧民的主要生存来源之一[5-8]。干制发酵乳制品是指由原料乳经当地代代相传的传统技艺处理，在自然条件下发酵并正常干制而成。曲拉是由脱脂后的牦牛奶在自然条件下发酵凝固并风干制成的粗干制发酵乳制品，属于西藏自治区典型的手工干制发酵乳制品[9-10]。酸奶疙瘩是由牛奶经自然发酵后自然干制而成，属于酸奶的结晶体，是新疆牧民自制的典型干制发酵乳制品[11]。奶渣子是将分离出油脂的奶进行发酵，再将其中的水分晾干，属于内蒙牧区常见的手工干制发酵乳制品之一[12]。乳扇是由牛乳自然发酵并经过凝乳、热烫、拉伸等工艺而制成，属于云南典型的干制发酵乳制品[13]。干制发酵乳制品具有蛋白质含量高、益生菌种类多、保存时间长，携带方便等特点，在西藏、内蒙、新疆、云南4 个地区被广泛制作并食用[14]。

传统基于细菌分离、纯化、培养及鉴定的研究方法不易获得痕量微生物，难以将环境中完整的细菌种群结构及生态关系展现出来[15]，高通量测序技术不仅可以检测到那些难培养和低丰度的细菌[16]，还可以排除挑选菌株时所产生的单一性，更能代表整体的细菌组成[17]，因此已经逐渐成为研究细菌组成及结构的一种重要方法，近年该技术已广泛用于原料乳和各类发酵乳等乳制品生态位的研究[18-20]。朱潇等[21]通过高通量测序技术比较了甘肃藏区传统牦牛发酵乳制品的细菌菌群多样性，麻和平等[22]通过高通量测序技术分析比较了不同保存温度下牦牛酸奶的细菌多样性，曾椿淋[12]通过高通量测序技术分析了内蒙古不同地区的手工干制发酵乳制品微生物多样性。然而，通过高通量测序技术分析我国不同省份地区干制发酵乳制品的群落结构和多样性却鲜有报道。

本研究分别从西藏、内蒙、新疆和云南4 个地区采集了4 种特色干制乳制品，这4 个地区分别位于中国的西北、西南、北部和南部，属于中国的边界省份，而且都盛产奶制品[23]。通过分析4 个地区特色干制发酵乳制品的基本营养成分以及细菌群落多样性，测定其游离氨基酸和短脂肪链酸含量，探讨细菌对干制乳制品品质的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

24 份干制乳制品样品：新疆的酸奶疙瘩（SNGD）、西藏的曲拉（QL）、内蒙的奶渣子（NZZ）、云南的乳扇（RS），不同地区干制乳制品的采集及分组信息如表1所示，均为2021年3月在农牧民家制作，密封运送至实验室，于-80 ℃低温冰箱中保存。

表1 干制乳制品的采集及分组信息Table 1 Information on collection and grouping of dry fermented dairy products

E.Z.N.A.®Soil DNA提取试剂盒 美国Omega Bio-Tek公司；琼脂糖 西班牙Biowest公司；FastPfuDNA聚合酶 北京全式金生物技术股份有限公司；AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒 美国Axygen Biosciences公司；MiSeq Reagent Kit v3 美国Illumina公司；邻苯二甲醛、氯甲酸-9-芴基甲酯、3-巯基丙酸、17 种氨基酸混合标准品（2.5 μmol/mL）、天冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸、正缬氨酸、色氨酸、21-羟脯氨酸、肌氨酸标准品（均为分析纯） 德国Sigma公司；浓盐酸、硼酸、氢氧化钠、二水合磷酸二氢钠、十二水合磷酸氢二钠（均为分析纯） 广州化学试剂厂；甲醇、乙腈（均为色谱纯）上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

JD-3型电子天平 辽宁省沈阳龙腾电子有限公司；101-2型恒温干燥箱 上海普瑞赛斯仪器有限公司；KND-04型自动凯氏定氮仪 上海沛欧分析仪器公司；SX2-2.5-12型马弗炉 北京独创科技有限公司；N13462C型移液器、5430 R型小型离心机 德国Eppendorf公司；MiFly-6微型离心机 安徽省合肥艾本森科学仪器有限公司；NanoDrop 2000超微量分光光度计 美国Thermo Fisher Scientific公司；DYY-6C型电泳仪 北京市六一仪器厂；GeneAmp®9700型聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）仪美国应用生物系统公司；QuantiFluorTM-ST微型荧光计美国Promega公司；Illumina MiSeq测序仪、Illumina MiSeq PE300型高通量测序仪 美国Illumina公司；QL-901型旋涡混合器 江苏省海门市其林贝尔仪器制造有限公司；TL-48R型粉碎研磨仪 上海万柏生物科技有限公司；7890A-5975C气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）联用仪、DB-WAX色谱柱（0.25 mm×50 m，0.25 μm）、1100液相色谱（liquid chromatography，LC）仪 美国安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 基本营养成分的测定

根据GB 5009.6—2016《食品中脂肪的测定》[24]、GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》[25]、GB 5413.5—2010《婴幼儿食品和乳品中乳糖、蔗糖的测定》[26]、GB 5009.4—2016《食品中灰分的测定》[27]、GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》[28]的方法测定干制乳制品样品中脂肪、蛋白质、乳糖、灰分及水分含量。

1.3.2 DNA抽提和PCR扩增

根据E.Z.N.A.®Soil DNA提取试剂盒的说明书进行总DNA抽提，利用NanoDrop 2000超微量分光光度计测定DNA浓度和纯度，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA 提取质量。使用PCR 以引物对338 F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）扩增16S rRNA基因的V3～V4可变区。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min，27 个循环（95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s），最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增体系（20 μL）为：4 μL 5×FastPfu缓冲液，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL 5 μmol/L引物，0.4 μL FastPfuDNA聚合酶，10 ng DNA模板。

1.3.3 Illumina MiSeq测序

使用2%琼脂糖凝胶回收PCR产物，利用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒进行纯化，Tris-HCl洗脱，2%琼脂糖电泳检测。利用QuantiFluorTM-ST微型荧光计进行检测定量。根据Illumina MiSeq平台标准操作规程将纯化后的扩增片段构建PE 2×300文库。构建文库步骤：连接“Y”字形接头，使用磁珠筛选去除接头自连片段，利用PCR扩增进行文库模板的富集，氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。利用MiSeq PE300型高通量测序仪进行测序。

1.3.4 脂肪酸的提取及GC-MS分析

参考贾益群等[29]的方法，向离心管中加入1 mL 0.5 mol/L硫酸溶液，加盖密封，40 ℃、35 kHz超声振荡20 min。冷却后，准确加入4 ℃、1 mL乙醚，用记号笔记下液面位置，剧烈振荡5 min后，置于冰箱（4 ℃）中静置放置30 min，补加乙醚至标记刻度，10000 r/min离心5 min，取上层乙醚溶液进行GC-MS分析[30]。混合标准品配制：分别称量一定质量标准品混合，用丙酮溶解，定容至50 mL，按分析要求稀释一定倍数后上机测定。

GC条件：进样口温度250 ℃；接口温度250 ℃；载气流速1.5 mL/min；分流比3∶1；进样量1 μL；升温程序：初始70 ℃，保持3 min；以10 ℃/min升温到100 ℃，保持2 min；8 ℃/min升温到180 ℃，保持0 min；10 ℃/min升温到250 ℃，保持15 min。

MS条件：电子电离源；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电离能量70 eV；全扫描模式；质量范围m/z35～550。

实验结果与美国国家标准与技术研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）标准谱库对比分析，确认物质化学结构和名称，使用特征离子外标法进行定量分析[31]。

1.3.5 游离氨基酸提取及LC分析[32]

将样品研碎，称取0.5 g样品于10 mL离心管中，加5 mL 0.01 mol/L HCl溶液（或纯水），混匀，沸水浴30 min，10000 r/min离心10 min，取上清液。沉淀再加2 mL 0.01 mol/L HCl溶液悬浮超声5 min，13000 r/min离心15 min，合并上清液，定容至10 mL，过膜测定。

采用安捷伦公司自动在线衍生化方法，一级氨基酸与邻苯二甲醛、二级氨基酸与芴甲氧羰酰氯衍生后过柱检测。LC条件：ZORBAX Eclipse AAA色谱柱（4.6 mm×75 mm，3.5 μm）；流动相：A为pH 7.840 mmol/L磷酸二氢钠；B为乙腈-甲醇-水（45∶45∶10，V/V）；流速1.0 mL/min；梯度洗脱程序如表2所示；在338 nm（0～19 min）、266 nm（19.01～25 min）波长处检测信号。

表2 梯度洗脱程序Table 2 Gradient elution program

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 不同地区干制发酵乳制品基本营养成分分析

脂肪可以影响干制发酵乳制品的硬度、黏性、口感和风味。干制发酵乳制品与其他种类乳制品相比具有高质量蛋白质，含有满足人体正常生理代谢所需的氨基酸。如表3所示，与其他地区相比，云南乳扇的脂肪含量最高，这可能是因为传统制作方式中，为延长乳扇贮藏期在制作时添加了植物油[33]。与其他地区相比，新疆酸奶疙瘩的蛋白质含量最高，脂肪含量最低，具有高蛋白低脂肪的特性，这与王绒雪等[34]在新疆地区采集的两种酸奶疙瘩样品的研究结果较为相似。此外，西藏曲拉和内蒙奶渣子基本营养成分的各项指标较为接近，这可能与他们极其相似的制作方式有关。乳制品中的营养成分含量随制作方式、乳品种、所在区域省份及气候等条件的变化而变化，所以不同地区干制发酵乳制品其脂肪、蛋白质以及乳糖等含量存在一定差异。

表3 不同地区干制发酵乳制品的基本营养成分Table 3 Basic nutrient compositions of dry fermented dairy products from different regions

2.2 不同地区干制发酵乳制品α多样性分析

α多样性反映出不同地区乳制品的物种多样性与丰富度，如表4所示，Illumina MiSeq测序从各区域采集的干制发酵乳制品样本共获得2421338 条reads，其中clean reads为1871524 条。由表4可知，云南乳扇中细菌Chao1指数和Shannon指数均明显高于西藏的曲拉、新疆的酸奶疙瘩以及内蒙的奶渣子，表明云南乳扇中细菌微生物群落的种群差异性相对较大、群落多样性较高。Chao1指数的结果与Observed OTUs的结果相似，这是因为通常用Chao1算法估计样品中所含OTUs数目的指数，用来估计物种数，即Chao1指数就是OTUs数的一个反应指标，进一步证明了云南乳扇中细菌微生物群落多样性以及总体丰度较高。

表4 不同地区干制乳制品细菌多样性Table 4 Bacterial diversity of dry fermented dairy products from different regions

2.3 不同地区干制乳制品中细菌微生物组成

由图1 a 可知，4 种干制乳制品的优势门均为Firmicutes，其中新疆酸奶疙瘩的丰度最高。由图1b可知，内蒙奶渣子最丰富的科为Streptococcaceae；西藏曲拉的主要科为Lactobacillaceae、Acetobacteraceae、Streptococcaceae和Enterococcaceae；云南乳扇的主要科为Streptococcaceae和Lactobacillaceae；新疆酸奶疙瘩的主要科为Lactobacillaceae和Streptococcaceae。由图1c可知，内蒙奶渣子和云南乳扇都以Lactococcus为主；西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩中最丰富的属均为Lactobacillus，第二主要属分别为Acetobacter和Streptococcus。

图1 不同地区干制乳制品门（a）、科（b）、属（c）水平各样本菌群分布图Fig.1 Distribution of bacterial flora at the level of phylum (a),family (b) and genus (c) in dry fermented dairy products from different regions

通过LEfSe分析，以前6 个特征菌为代表，由图2可知，内蒙奶渣子的特征菌有Lactococcus、Streptococcaceae、Enterobacteriaceae、Enterobacteriales、Serratia和Halomonadaceae。西藏曲拉代表性细菌微生物有Rhodospirillales、Alphaproteobacteria、Acetobacteraceae、Acetobacter、Proteobacteria和Enterococcaceae。云南乳扇中的特征菌有Gammaproteobacteria、Pseudomonadales、Rahnella、Moraxellaceae、Archaea和Neisseriaceae。新疆酸奶疙瘩中，鉴定出了Lactobacillaceae、Lactobacillus、Firmicutes、Lactobacillales、Bacilli和Streptococcus。

图2 不同地区干制乳制品LEfSe分析图Fig.2 LEfSe analysis of dry fermented dairy products from different regions

2.4 不同地区干制乳制品中脂肪酸分析

脂肪酸在干制乳制品风味中起着重要作用，它们能抑制致病菌的生长，促进益生菌的生长。高乙酸含量会导致干制乳制品的不良风味，通过对16 种脂肪酸的评价，乙酸含量与总脂肪酸含量相比较少（表5）。由表5可知，云南乳扇中的16 种脂肪酸均高于其他3 个地区，丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬酯酸含量最为明显。这可能与云南乳扇的生产工艺有关，制作过程中会将木瓜提取的酸水加入鲜奶中，酸和热加速了奶的凝固，酸水在一定程度上引入了系列复合酶，从而引发系列水解反应，导致乳扇中有相对较多的脂肪酸类物质。云南乳扇中的棕榈酸含量最高，棕榈酸稳定性比较好，可以用来增加食品的色泽，所以乳扇的外表光滑、色泽油亮。内蒙奶渣子、西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩的硬酯酸含量最高，硬脂酸是脂肪酸的重要成分，能迅速转化为单不饱和脂肪酸油酸。此外，共轭油酸也是干制发酵乳制品脂肪中的有益成分，具有抗癌、抗脂肪形成、抗动脉粥样硬化、抗糖尿病和抗炎等多种生物活性，适量摄入对人体健康有益。

表5 不同地区干制乳制品中的主要脂肪酸Table 5 Major fatty acids in dry fermented dairy products from different regions

2.5 不同地区干制乳制品中游离氨基酸分析

干制乳制品中的游离氨基酸有助于风味的形成，可作为分解代谢反应的前体产生酮酸、氨、胺、醛、酸和醇，从而产生干制乳制品的风味和香气。由表6可知，共检出24 种游离氨基酸，新疆酸奶疙瘩的游离氨基酸种类最为丰富，包含了24 种游离氨基酸，而且多数游离氨基酸含量高于其他3 个地区的干制乳制品，因为新疆酸奶疙瘩的蛋白质含量与其他3 个地区的干制发酵乳制品相比最高（表3），而乳制品在发酵过程中通过酶的作用可以使蛋白质分解产生氨基酸。其中，谷氨酰胺、组氨酸、苏氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸只存在与新疆酸奶疙瘩中，所以新疆酸奶疙瘩的风味最为丰富。在4 个地区不同的干制乳制品中，只有内蒙奶渣子不含缬氨酸，西藏曲拉不含酪氨酸。干制发酵乳制品中氨基酸的存在对其质量与风味都有直接作用，精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸及亮氨酸主要呈现苦味，谷氨酸、苏氨酸、天冬氨酸具有酸味，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸具有甜味[35]。

表6 不同地区干制乳制品中的游离氨基酸Table 6 Free amino acids in dry fermented dairy products from different regions

2.6 细菌微生物群落与脂肪酸和游离氨基酸的关系

利用RDA研究细菌微生物群落与α多样性、脂肪酸和游离氨基酸的关系，如图3所示，RDA1和RDA2分别占总方差的44.31%和22%。在西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩中，丙氨酸与醋杆菌Acetobacter、乳杆菌Lactobacillus和链球菌Streptococcus相关。在云南乳扇中，高含量的乙酸和丁酸与Acinetobacter相关，同时，羟脯氨酸也与Acinetobacter相关。因此，不同地区干制发酵乳制品中的微生物群落与其风味和营养成分息息相关。

图3 细菌微生物群落与脂肪酸和游离氨基酸的RDAFig.3 RDA plot showing the relationship of bacterial communities with fatty acids and free amino acids

3 讨论

内蒙的奶渣子、西藏的曲拉、云南的乳扇和新疆的酸奶疙瘩的基本营养成分和细菌微生物丰富度和多样性均存在一定差异。其中，与其他地区相比，云南乳扇中水分含量和细菌微生物群落多样性以及总体丰度最高，这可能与云南乳扇独特的制作方式以及较多的环境微生物有关。首先，云南乳扇是鲜牛乳巴氏杀菌后，充分凝乳形成凝块后进行热烫洗涤，然后借助木杆将其拉伸成独特的纸扇形状上架晾干而制成，制作工艺相对复杂，制作流程相对较多[36]，与环境的接触更为密集。其次，云南是中国的旅游大省，流动人口远高于新疆、西藏和内蒙3 个地区[37]，环境微生物相对于其他地区更加复杂多样。

内蒙的奶渣子、西藏的曲拉、云南的乳扇和新疆的酸奶疙瘩都含有Lactobacillus、Lactococcus和Streptococcus，这些细菌利用乳糖和其他碳水化合物、脂肪、蛋白质和肽，产生短肽、游离氨基酸、脂肪酸和芳香化合物，在风味形成和营养成分中发挥重要作用[38]。Lactococcus是中国传统干制发酵乳制品和西方干制发酵乳制品的主要菌属[39]。本研究中，云南乳扇和内蒙奶渣子中Lactococcus的含量最高，西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩中最丰富的属为Lactobacillus。Lactobacillus所表达的酶能够分解苯丙氨酸和酪氨酸，从而产生芳香化合物，使西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩散发出特殊的香味[40]。在RDA图中，Acinetobacter增加了云南乳扇中的丁酸含量，丁酸由微生物代谢产生，与病理性疾病有关。丁酸作为主要能量来源被结肠上皮吸收，从而增强肠道屏障功能[41]。而且只有云南乳扇中含有丙酸，丙酸参与了干制乳制品特有风味的形成，对Salmonella、Escherichia、Listeria monocytogenes等病原菌也有抑制作用[42]。因此，云南乳扇可能比内蒙的奶渣子、西藏的曲拉和新疆的酸奶疙瘩更健康。一般而言，干制发酵乳制品脂肪中含有66%的饱和脂肪酸、30%的单不饱和脂肪酸，硬脂酸和棕榈酸是干制乳制品饱和脂肪酸的重要组成部分[43]，所以4 个牧区的传统干制发酵乳制品的硬脂酸和棕榈酸含量较高。综上所述，不同的加工工艺导致4 个牧区传统干制发酵乳制品的微生物组成不同，这可能会影响微生物代谢产生的氨基酸和脂肪酸的含量，从而导致营养成分和风味的差异。

不断增加的人类活动，包括工业化、城市化、人口、旅游业和其他变化，可以改变近地表大气中环境微生物的数量和类型[44]。内蒙的奶渣子、西藏的曲拉、云南的乳扇和新疆的酸奶疙瘩是中国4 个牧区的传统干制发酵乳制品，没有添加发酵剂乳酸菌。与大多数西方干制发酵乳制品不同的是，它们的细菌微生物几乎完全来自环境。结果表明，奶渣子、曲拉、乳扇和酸奶疙瘩可作为研究中国不同地理区域与环境微生物关系的指示性案例。在4 个牧区中，乳扇的细菌微生物群落显著丰富，其次是奶渣子和酸奶疙瘩，最后是曲拉。因为，曲拉产于西藏，西藏的生态环境质量最好，工业化、城市化和人口规模最小，这反映了云南乳扇可能比其他3 种干制发酵乳制品受到更多的环境污染。这种污染在干制发酵乳制品生产过程中普遍存在，应该在进一步研究干制发酵乳制品细菌微生物群时加以考虑。

众所周知，微生物在发酵过程中对风味代谢产物的特性起着至关重要的作用。此外，干制发酵乳制品成熟过程中复杂的微生物组成与多种代谢物的形成有关，这是干制发酵乳制品风味多样化的潜在工具[45]。本研究测定了干制发酵乳制品样品中24 种游离氨基酸的含量，其中酸奶疙瘩中多数氨基酸的含量高于乳扇、曲拉和奶渣子。芳香氨基酸、支链氨基酸和含硫氨基酸等游离氨基酸的产生，是干制发酵乳制品独特风味和香气的形成因素[46]。同时，乳扇生产地区丁酸含量最高、人口最多。丁酸不仅是一种益生菌，也是干制发酵乳制品的一种香味。研究表明，陈年干制发酵乳制品的味道非常浓郁，这可能与丁酸有关[47]。综上所述，地理区域与人口、旅游等人类活动相结合，可能会影响干制发酵乳制品的细菌微生物丰富度、多样性、组成以及干制发酵乳制品的风味。

4 结论

采用国标中的系列方法对基本营养成分进行测定，利用高通量测序技术，对中国4 个主要牧区特色干制发酵乳制品的细菌微生物群落结构进行分析，同时测定游离氨基酸和脂肪酸的含量并对其进行RDA。研究表明，云南乳扇中水分含量和细菌微生物多样性最高，脂肪含量和16 种脂肪酸含量均高于其他3 个地区。新疆酸奶疙瘩的蛋白质含量和游离氨基酸种类最为丰富，检测到24 种游离氨基酸，而且多数游离氨基酸含量高于其他3 个地区的干制发酵乳制品。在4 个地区不同的干制发酵乳制品中，只有内蒙奶渣子不含缬氨酸，西藏曲拉不含酪氨酸。在西藏曲拉和新疆酸奶疙瘩中，丙氨酸与Acetobacter、Lactobacillus及Streptococcus相关。由此可见，不同的地理位置和环境条件会在很大程度上改变细菌微生物的数量和种类，导致干制发酵乳制品中细菌微生物的分布和化学成分不同。本研究为我国各省份传统干制发酵乳制品的工业化生产提供了一定理论支持。