酵母甘露糖蛋白体外发酵及其代谢产物的抗炎活性

李 祥，陈贵杰，康贻军,*，Amirsalar KHANDAN

（1.盐城师范学院海洋与生物工程学院，江苏省盐土生物资源研究重点实验室，江苏 盐城 224051；2.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095；3.阿米尔卡比尔理工大学新技术研究中心，伊朗 德黑兰 84175119）

人的胃肠道中栖居着数以万亿计的微生物，其中细菌主要包括厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、疣微球菌门（Verrucomicrobia）、梭杆菌门（Fusobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）和变形菌门（Proteobacteria）等，其中结肠中栖居约1014个细菌，这些细菌在结肠中形成了一个复杂的微生态系统[1-2]。越来越多的研究表明肠道菌群与宿主的健康及维持机体正常的生理机能息息相关，包括营养物质吸收与代谢、促进骨骼发育、抵御外源病原微生物、维生素及神经传导物质合成等。然而肠道菌群紊乱会诱导肥胖、糖尿病、高血压、结肠炎癌症等多种疾病[3-5]。因此维持宿主肠道菌群稳态对维护人体健康、预防疾病具有重要意义。

作为人体最庞大、最复杂的微生态系统，肠道微生物本身及代谢产物不仅能调节人体健康，更在膳食和宿主之间起到了重要的桥梁作用。膳食干预是调节肠道微生物群的最有效方法之一，其中膳食纤维不会被人体消化系统消化吸收从而到达大肠，并在大肠与肠道菌群发生相互作用，其中膳食纤维可以促进双歧杆菌属（Bifidobacterium）、副拟杆菌属（Parabacteroides）、乳杆菌科（Lactobacillaceae）等有益菌增殖并抑制大肠杆菌属（Escherichia）、志贺氏菌属（Shigella）等有害菌生长，同时膳食纤维可以被肠道菌群代谢成短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）[6-8]。通过膳食纤维调节肠道微生物群改善宿主健康已被广泛研究和报道。如枸杞多糖体外可以促进拟杆菌属（Bacteroides）、Bifidobacterium、普氏菌属（Prevotella）等有益菌的增殖，同时增加乙酸、丙酸和丁酸的含量[9]。因此膳食纤维作为一种潜在的益生元受到越来越多的关注。

甘露糖蛋白（mannoprotein，MP）约占酵母细胞壁外层的35%～45%，是酵母细胞壁重要组成成分，MP不仅可以在保持酵母形状中发挥作用，还可以保护酵母细胞免受渗透压的影响[10]。甘露糖通过共价键与蛋白质链接形成MP共聚物，其中蛋白约占5%～20%，甘露糖占80%～90%，分子质量在20～200 kDa之间[11]。酵母MP具有较好的乳化特性，特别在红酒加工中具有潜在的商业价值[12]。近年研究表明，酵母MP具有调节免疫、抗肿瘤等生物活性[10,13]。但酵母MP体外发酵特性及对肠道微生物的影响依然未知。因此，本研究利用体外厌氧发酵模型结合高通量测序研究酵母MP在体外的益生活性，利用气相色谱检测MP的代谢产物SCFAs含量，利用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导的RAW 264.7炎症细胞模型评价MP及其代谢产物的抗炎活性。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MP 安琪酵母股份有限公司；MGC AnaeroPack®-Anaero厌氧盒和厌氧产气包 日本三菱公司；菊粉、SCFAs 标准品（包括乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸）、岩藻糖（Fuc）、鼠李糖（Rha） 阿拉丁试剂（上海）有限公司；内标（2-乙基丁酸）、木糖（Xyl）、核糖（Rib）、葡萄糖（Glc）、半乳糖醛酸（GalA）、半乳糖（Gal）、阿拉伯糖（Ara）、甘露糖（Man）西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；粪便DNA提取试剂盒 北京天根生化科技有限公司；RAW 264.7细胞 中国科学院细胞库（上海）；Dulbecco’s Modified Eagle Medium（DMEM）高糖培养基、双抗、胎牛血清 美国Gibco公司；来源于大肠杆菌的LPS、3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮（3-methyl-1-phenyl-2-pyrazolin-5-one，PMP） 美国Sigma公司；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factorα，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin 6，IL-6）ELISA试剂盒 深圳欣博盛生物科技有限公司；一氧化氮（NO）试剂盒 上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 仪器与设备

6890N型气相色谱仪 美国Agilent公司；MJX-160B-Z型霉菌培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；AY-120/BL-220H型电子天平 日本Shimadzu公司；LDZX-50KBS灭菌器 上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 MP分子质量和单糖组成测定

MP分子质量利用液相色谱结合高效凝胶渗透色谱（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）和示差检测器测定，色谱柱为TSK G4000PWXL柱（7.8 mm×300 mm），流动相为0.1 mol/L氯化钠溶液，流速0.5 mL/min，液相色谱柱温箱温度35 ℃，MP质量浓度为2 mg/mL，样品过完0.45 μm膜后进样，进样量20 μL。

MP单糖组成根据Chen Guijie等[14]衍生化方法进行测定。100 μL 6 mg/mL样品溶液与100 μL 4 mol/L三氟乙酸溶液混合密封后在120 ℃条件下水解2 h，水解后入200 μL的甲醇后旋蒸。旋干后加入100 μL蒸馏水溶解并加入100 μL 0.6 mol/L NaOH溶液，充分混合取100 μL溶液与100 μL 0.5 mol/L PMP-甲醇溶液混合，并在70 ℃水浴中反应100 min。衍生化反应后加入盐酸溶液（0.3 mol/L）进行中和反应。溶液旋蒸干后加入1 mL的去离子水复溶，同时加入1 mL的氯仿萃取并去除未反应的PMP，最终得到溶液用于液相色谱检测。流动相为0.1 mol/L磷酸盐缓冲液（pH 6.7）与乙腈按照体积比为83∶17的混合液，流速1 mL/min，检测波长245 nm，色谱柱为Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温为35 ℃，样品进样量为20 μL。

1.3.2 体外模拟肠道微生物厌氧发酵

MP的体外厌氧发酵模型按照Chen Guijie等[14]方法并稍作修改。4 位近半年内没有接受过抗生素治疗且没有胃肠道疾病的志愿者（年龄均在20～30 岁之间）提供新鲜粪便，将粪便样品与改性生理盐水（含9.0 g/L NaCl和0.5 g/L半胱氨酸盐酸盐）以1∶9比例稀释后，500×g离心得到10%的菌群悬浮液。将0.5 g胆汁盐、1 mg刃天青、4 g酵母提取物、0.46 g半胱氨酸盐酸盐、2 g蛋白胨、0.02 g血红蛋白、10 μL VK1、2.0 mL吐温80、0.04 g KH2PO4、2.0 g NaHCO3、0.1 g NaCl、0.01 g MgSO4、0.04 g K2HPO4、0.01 g CaCl2溶于1 L去离子水中，调节pH 7.0，得到基础培养基。将1 mL 10%菌群悬浮液与9 mL含100 mg MP的基础培养基混合放入培养瓶中，转入放有厌氧产气包的MGC AnaeroPack®-Anaero厌氧盒中，37 ℃进行厌氧发酵，不加碳源的作为空白对照（BLK），菊粉作为阳性对照（INL），发酵前样本为ORI组，培养24 h后取样用于进一步实验。

1.3.3 pH值和SCFAs的测定

发酵24 h后利用pH计测定不同组发酵液的pH值。利用气相色谱测定不同组发酵液中的SCFAs水平（包括乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸和异戊酸）[15]。将2-乙基丁酸溶解到0.2 mol/L HCl溶液中，配制0.3 mg/mL的内标溶液，将样品与内标溶液等体积混合、离心、过膜后用于气相色谱检测。色谱柱为HP-INNOWAX毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；检测器为火焰离子化检测器；升温程序：100 ℃并保持1 min，以5 ℃/min的速度升至180 ℃，保持4 min；氮气（N2）作为载气，流速19.0 mL/min；进样量1 μL。

1.3.4 肠道微生物分析

体外发酵液10000×g离心后，利用粪便DNA提取试剂盒提取沉淀中细菌DNA，送到杭州联川生物技术股份有限公司Illumina MiSeq平台进行16S rDNA序列测序，测序的原始数据通过Cutadapt、fastx、FLASH、Usearch软件进行质控，按照97%的相似性归并到一个可操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU），通过mothur软件比对OTU和SILVA（Release 132,https://www.arb-silva.de/documentation/release-132/）数据库确定种属信息。利用R语言软件（https://www.r-project.org/）计算肠道微生物的α多样性和β多样性。

1.3.5 细胞实验

根据Wan Peng等[16]方法并稍作修改。复苏后的RAW 264.7细胞接种在含有10%胎牛血清、1%双抗的DEME高糖培养基中，在5% CO2、温度37 ℃细胞培养箱中培养。细胞培养5～6 代稳定后，按照200 μL体积接入到96 孔细胞培养板中。培养24 h后，弃掉旧培养基并加入200 μL含有质量浓度为0、50、100、200、400、800、1000、1500、2000 μg/mL MP样品的培养基，培养4 h后加入LPS溶液，使最终培养基中LPS质量浓度为2 μg/mL。继续培养24 h，利用细胞活力检测法检测MP对RAW 264.7细胞的毒性。按照上述方法，将RAW 264.7细胞接种在96 孔板中培养24 h后，利用不同质量浓度（0、50、100、200、400、800 μg/mL）的MP处理2 h，加入LPS继续培养24 h，利用NO试剂盒检测培养基中NO水平。按照上述方法，将1 mL的RAW 264.7细胞接种在12 孔板中，利用不同质量浓度（0、50、100、200、400、800 μg/mL）的MP处理2 h，加入LPS继续培养24 h，利用ELISA试剂盒检测培养基中TNF-α、IL-1β和IL-6含量。利用细胞培养基将MP发酵液（初始MP质量浓度10 mg/L）稀释到相应的MP质量浓度，BLK和INL组也按照MP稀释倍数进行稀释，按照上述方法评价MP、INL、BLK发酵液的抗炎活性。为了进一步验证SCFAs的抗炎症活性，根据1.3.3节检测结果，选取不同浓度的乙酸（5、10、15 mmol/L）、丙酸（5、10、15 mmol/L）和丁酸（2、4、6 mmol/L）进行抗炎症活性评价。

1.4 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2.1 MP化学组成

对MP的化学组成进行初步研究，MP中含有多糖（86.3±2.37）%、蛋白（14.6±1.45）%，利用Folin-Ciocalteu法未检测到多酚含量。如图1所示，利用液相色谱检测MP的分子质量为78 kDa，单糖组成分析结果表明MP主要由甘露糖和微量葡萄糖组成，其物质的量比约为11.2∶1。

图1 MP分子质量HPGPC图（a）及单糖混标（b）、MP样品PMP-衍生化产物（c）的HPLC图Fig.1 HPGPC chromatogram of MP (a),and HPLC chromatograms of standard mixture of saccharides (b) and PMP derivatives of MP (c)

2.2 MP对肠道微生物多样性的影响

利用Illumina Novaseq平台对体外发酵样品中细菌16S rDNA V3～V4区域进行高通量测序，研究MP对肠道菌群的影响。表1显示，BLK组具有较低的OTU数和Chao1指数（P＜0.05），因此，没有碳源条件下菌群包含物种的数目显著降低，然而BLK组的Shannon指数和Simpson指数均显著高于其他组，说明BLK组肠道菌群多样性高于其他组。MP组的OTU数、Shannon指数、Simpson指数和Chao1指数与ORI和INL组均没有显著差异（P＞0.05）。如图2所示，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）、主坐标分析（principal co-ordinates analysis，PCoA）和基于Bray-Curtis距离的聚类分析评价不同处理组肠道菌群的结构差异，结果发现，同一组样品聚在一起而不同处理组样品显著分开，表明不同处理组肠道菌群结构有显著差异（P＜0.05），同时，INL组、MP组与ORI组样品靠的比较近，说明这3 组肠道菌群结构类似而与BLK组显著不同，说明MP可能与菊粉具有类似的益生活性。

表1 MP对肠道微生物丰富性和α多样性的影响Table 1 Effect of MP on the richness and α-diversity of gut microbiota

图2 MP对肠道微生物β多样性的影响Fig.2 Effect of MP on the β-diversity of gut microbiota

2.3 MP对肠道菌群组成的影响

图3 显示，不同组肠道菌群均由Firmicutes、Bacteroidetes、Proteobacteria、Actinobacteria组成。肠道菌群组成与其他文献的结果一致[14]。然而，与ORI组相比，发酵后BLK组的Firmicutes相对丰度显著增加，而Bacteroidetes相对丰度显著降低进而导致Firmicutes/Bacteroidetes比例显著增加。而菊粉和MP的添加均可以显著降低Firmicutes相对丰度，而显著增加Bacteroidetes相对丰度，从而降低Firmicutes/Bacteroidetes比值。同时，BLK组的Proteobacteria显著增加，而菊粉和MP均可以显著降低Proteobacteria相对丰度，此外，菊粉可以显著增加Actinobacteria的相对丰度，但MP对Actinobacteria没有显著影响。

图3 MP对肠道微生物门水平组成的影响Fig.3 Effect of MP on the composition of gut microbiota at the phylum level

本研究选取在科水平相对丰度前20的肠道微生物做显著性分析（表2），相比于ORI组，BLK组中拟杆菌科（Bacteroidaceae）、疣微菌科（Ruminococcaceae）、红蝽菌科（Coriobacteriaceae）、Lactobacillaceae相对丰度显著降低，而毛螺菌科（Lachnospiraceae）、肠杆菌科（Enterobacteriaceae）、韦荣球菌科（Veillonellaceae）、萨特氏菌科（Sutterellaceae）、氨基酸球菌科（Acidaminococcaceae）、紫单胞菌科（Porphyromonadaceae）、链球菌科（Streptococcaceae）、梭杆菌科（Fusobacteriaceae）、疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）、丹毒丝菌科（Erysipelotrichaceae）、梭菌科（Clostridiaceae）相对丰度显著增加，然而菊粉和MP干预均可以逆转BLK组的肠道菌群，其中INL和MP均可以增加Bacteroidaceae、普雷沃菌科（Prevotellaceae）、Lactobacillaceae并且降低Lachnospiraceae、Enterobacteriaceae、Sutterellaceae、Porphyromonadaceae、Streptococcaceae、Fusobacteriaceae、Verrucomicrobiaceae、Erysipelotrichaceae，因此INL和MP具有相似的调节肠道菌群的活性，INL可以显著增加双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）的增殖，而MP对Bifidobacteriaceae相对丰度没有显著影响。

表2 科水平相对丰度前20肠道微生物的比较分析Table 2 Comparative analysis of top 20 families with the largest relative abundance in gut microbiota%

对属水平相对丰度前20的肠道微生物的进行统计分析，结果如表3所示。相对于ORI组，发酵后BLK组的Bacteroides、粪杆菌属（Faecalibacterium）、Lachnospiracea_incertae_sedis、柯林斯氏菌（Collinsella）、罗斯氏菌属（Roseburia）显著降低，而Escherichia、Lachnospiraceae_unclassified、副萨特氏菌属（Parasutterella）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）、韦荣球菌属（Veillonella）、克雷白氏杆菌属（Klebsiella）、布劳特氏菌属（Blautia）、链球菌属（Streptococcus）、Clostridium_XlVb、Parabacteroides、梭菌属（Fusobacterium）显著升高。MP和INL组可以显著调节Bacteroides、Esc her ic hia、Lac hnospira ce ae_uncla ssified、Parasutterella、Faecalibacterium、Klebsiella、Collinsella、Streptococcus、Clostridium_XlVb、Parabacteroides、Fusobacterium。因此，菊粉和MP在科和属的水平都具有相似的益生活性。利用LEfSe对发酵后样品（BLK、INL和MP组）相对丰度大于0.1%的OTU继续进行差异化分析，图4结果表明，BLK、INL和MP组共有41 个差异OTU，其中BLK、INL和MP分别有20、12 个和9 个OTU显著大于其他两组，其中INL组有5 个OTU（OTU39795、OTU39651、OTU39814、OTU41158、OTU39766）属于Bifidobacterium，均显著增加，其中3 个OTU 鉴定为假小链双歧杆菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum），1 个OTU鉴定为长双歧杆菌（Bifidobacterium longum），因此INL可以通过增加Bifidobacterium从而发挥其益生活性。MP主要增加了Bacteroides（OTU16459），同时可以显著增加Veillonella（OTU97和OTU7744）、Clostridium_sensu_srticto（OTU47674）、Blautia（OTU46124）、Faecalibacterium（OTU43046）、Fusicatenibacter（OTU47625）、Butyricicoccus（OTU41468）。

表3 属水平相对丰度前20肠道微生物的比较分析Table 3 Comparative analysis of top 20 genera with the largest relative abundance in gut microbiota %

图4 利用LEfSe在OTU水平分析BLK、INL和MP组肠道微生物的差异Fig.4 Comparison of gut microbiota among the BLK,INL and MP groups at the OTU level using LEfSe

2.4 pH值和SCFAs的测定结果

膳食纤维在肠道中被肠道菌群利用并代谢成SCFAs，其中乙酸、丙酸和丁酸是肠道菌群代谢的主要代谢产物，并且SCFAs可以被人体吸收进入内循环进而维持人体健康、预防各种疾病[17-18]。本研究测定了发酵后不同组发酵液中乙酸、丙酸、异丁酸、正丁酸、异戊酸和正戊酸的含量，从而了解肠道菌群对MP的代谢情况，并进一步评价MP的健康活性。如图5所示，乙酸、丙酸和丁酸是主要的代谢产物，其中INL可以显著增加正丁酸和正戊酸的水平，而MP组乙酸和丙酸浓度显著高于BLK和INL组（P＜0.05），同时，MP总酸含量显著高于BLK和INL组，因此结果表明MP与INL具有促进SCFAs的活性。检测发酵后发酵液pH值，发现INL和MP组pH值均显著低于BLK组（图6），可能跟INL和MP生成大量SCFAs有关[14]。

图5 发酵液中SCFAs含量Fig.5 Concentrations of SCFAs in fermentation both

图6 发酵液中pH值的变化Fig.6 Changes in pH of fermentation broth

2.5 发酵液抗炎活性

很多研究表明膳食纤维可以调节炎症[19]，因此，本研究利用细胞模型评价MP的抗炎症活性。首先研究MP的细胞毒性和抗炎症活性，图7结果表明，MP在0～400 μg/mL范围内对RAW 264.7没有显著毒性，LPS可以显著诱导RAW 264.7细胞分泌NO，表明LPS可以显著诱导RAW 264.7细胞产生炎症，然而MP在低剂量（50～100 μg/mL）时可以稍微降低NO产量，而高剂量（200～400 μg/mL）对NO没有显著影响。因此，MP本身对LPS诱导的细胞炎症调节活性有限，很多研究表明，膳食纤维可以通过调节肠道菌群及其代谢产物达到改善炎症活性，同时SCFAs等肠道菌群的代谢产物具有抗炎活性[20]。本研究发现，MP可以显著增加SCFAs的含量，因此本研究继续利用LPS诱导的RAW 264.7炎症细胞模型评价MP代谢产物的抗炎活性。图8表明，MP发酵液在稀释到0～400 μg/mL范围内对RAW 264.7没有显著毒性，BLK和INL组稀释到相同倍数时也没有显著细胞毒性。继续检测不同组发酵液对NO和炎症因子TNF-α和IL-6分泌量的影响，结果表明BLK、INL和MP组的发酵液均可以剂量依赖性降低NO、TNF-α和IL-6的水平，BLK组效果较差，而INL和MP组在抑制炎症因子释放均体现出优异的效果。

图7 MP对RAW 264.7巨噬细胞的细胞活力（a）和NO分泌量（b）的影响Fig.7 Effect of MP on the cell viability (a) and NO production (b) in RAW 264.7 macrophages

图8 发酵液对RAW 264.7巨噬细胞的细胞活力（a）、NO（b）、TNF-α（c）和IL-6（d）分泌量的影响Fig.8 Effect of fermentation broth on the cell viability (a),and the production of NO (b),TNF-α (c) and IL-6 (d) in RAW 264.7 macrophages

越来越多的研究表明膳食多糖的代谢产物SCFAs具有潜在抗炎症活性，而乙酸、丙酸和丁酸是MP发酵后的主要的代谢产物。因此本研究继续研究乙酸、丙酸和丁酸的抗炎症活性，如图9所示，乙酸、丙酸和丁酸均可以显著降低LPS诱导的巨噬细胞NO释放水平，同时丙酸和丁酸抗炎活性具有剂量依赖性，而乙酸虽然具有抗炎活性但是并没有显著剂量依赖性。因此本研究进一步证明了MP发酵后的抗炎活性可能来源于SCFAs的增加。

图9 乙酸、丙酸和丁酸对RAW 264.7巨噬细胞的细胞NO分泌量的影响Fig.9 Effects of acetic acid,propionic acid and butyric acid on the production of NO in RAW 264.7 macrophages

3 讨论

人体胃肠道中栖居着数以万亿计的微生物，并在肠道中形成了复杂的微生态系统[21]。肠道菌群与人体生理功能息息相关，比如可以抵御外源微生物入侵、促进免疫系统发育、营养物质的代谢吸收等，然而肠道微生物失调会导致肥胖、糖尿病、心血管疾病、癌症等各种疾病[3]。因此，维持肠道菌群平衡、调节肠道健康对人体健康意义重大。膳食纤维作为调节肠道菌群的潜在益生元收到越来越多的重视，很多文献报道，膳食纤维可以选择性促进Akkermansia、Lactobacillus、Bacteroides等有益菌的增殖、抑制Escherichia、Shigella等有害菌的增长，同时可以增加肠道中SCFAs浓度[22-24]。因此，挖掘具有肠道益生活性的膳食纤维对改善人们身体健康具有重要意义。

M P是由80%～95%甘露糖和5%～20%蛋白组成，是酵母细胞壁中重要的组成部分[25]。MP的研究主要集中在提取纯化、乳化特性及在葡萄酒中的作用机制[25-27]，然而，酵母MP的发酵特性和益生活性并没有相关报道，因此，本研究利用厌氧体外发酵模型研究酵母MP对肠道菌群的影响。结果表明，酵母MP可以显著调节肠道菌群结构，在门水平，菊粉和MP的添加均可以著降低Firmicutes相对丰度，而显著增加Bacteroidetes相对丰度，从而降低Firmicutes/Bacteroidetes比值。很多文献报道，Firmicutes/Bacteroidetes比值与宿主的能量代谢相关，Firmicutes/Bacteroidetes比值增加，能增加宿主对能量的吸收进而增加肥胖等代谢类疾病的风险[28-29]。因此菊粉和MP均具有通过调节肠道菌群从而改善宿主代谢健康的潜在活性，其中菊粉通过调节肠道菌群调节脂代谢的活性已经被广泛报道[30-31]，酵母中β-葡聚糖也被报道可以调节肠道菌群从而改善宿主代谢健康[32-33]，而MP调节脂代谢的活性需要进一步的研究。Proteobacteria中含有Escherichia等多种有害病原体，通常被认为是肠道菌群失调的微生物标志，Proteobacteria增值与人类许多疾病正相关[32,34]。因此，MP可以通过抑制Proteobacteria增殖从而改善宿主健康。在科水平和属水平，MP与菊粉都具有相似的调节肠道菌群的活性，不同的是菊粉可以显著增加Bifidobacterium相对丰度包括B.pseudocatenulatum和B.longum，其中B.pseudocatenulatum[35-36]和B.longum[37-38]的活性已经被广泛报道，因此菊粉具有优异的益生活性。而MP主要增加了Bacteroides、Veillonella、Clostridium_sensu_srticto、Blautia、Faecalibacterium、Fusicatenibacter、Butyricicoccus，其中Bacteroides可以水解利用膳食纤维并产生SCFAs[14,39-40]，Bacteroides具有免疫调节、降脂减肥等多种生物活性[41-42]。Blautia[43]、Faecalibacterium[44]、Butyricicoccus[45]的调节宿主健康的活性已经被广泛报道，因此，MP可以通过调节肠道菌群结构，促进Bacteroides等有益菌生长而抑制Escherichia有害菌增殖从而改善宿主健康。

不可消化的膳食纤维进入结肠后被肠道菌群水解利用并代谢成SCFAs，SCFAs会被肠上皮细胞吸收作为能量来源，同时，一部分SCFAs进入内循环参加宿主的各种生命活动[46-47]。因此，SCFAs的活性及其机制收到越来越多的关注，同时SCFAs水平也是评价益生元重要指标之一。本研究发现，相比于BLK和INL组，MP可以显著促进乙酸、丙酸和总酸水平，其中乙酸和丙酸均是结肠中主要的SCFAs，在结肠中浓度约为10～100 mmol/L[20]。乙酸和丙酸可以通过激活G蛋白偶联受体GPR43/FFAR2、GPR41/FFAR3、GPR109A/HCA2等发挥其活性[20,48]。因此MP可以通过增加结肠中SCFAs水平从而改善宿主健康。因此，继续利用LPS诱导的RAW 264.7炎症细胞模型评价MP及代谢产物的抗炎活性，结果发现，MP自己本身并不能抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞炎症，而MP的发酵液可以显著调节细胞的炎症反应，抑制NO和炎症因子的水平，并且其抗炎活性可能来自于SCFAs作用。因此MP可能是通过调节肠道菌群及代谢产物发挥其活性的，然而实验结论需要进动物实验一步验证。