后发酵温度对不同大豆品种细菌型豆豉氨基酸态氮生成动力学及理化性质的影响

李爱君，王 迪，阳 刚，宋 军，孔祥兵，廖胜蓝，阚建全,

（1.西南大学食品科学学院，农业农村部农产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室，中匈食品科学合作研究中心，川渝共建特色食品重庆市重点实验室，重庆 400715；2.重庆市永川区君意食品厂，重庆 402160）

豆豉是一种以大豆为原料，经微生物发酵而制成的食品。根据发酵时采用的微生物类型，豆豉可分为4 类：曲霉型（如浏阳豆豉）、毛霉型（如永川豆豉）、根霉型（如印尼丹贝）和细菌型（如日本纳豆）[1]。其中细菌型豆豉利用芽孢杆菌具有高蛋白酶活力的特点进行发酵，提高其多肽、总酚及总黄酮含量[2]，增强其抗氧化、清除血栓[3]和抗疲劳[4]的能力，并具有鲜、咸、酸、辣、略有回甘的丰富滋味。

大豆经过浸泡、蒸煮以及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）制曲这几种工序后（此时的细菌型豆豉与日本纳豆类似），可直接食用，但为了使其滋味更加丰富，通常向其中加入花椒、辣椒、生姜及食盐水进行保温后发酵，故后发酵阶段是细菌型豆豉风味和滋味形成的重要阶段[5]。影响豆豉营养成分和感官特性的因素有很多，其中，大豆品种和后发酵温度的选择尤为重要。有研究表明不同大豆的氨基酸、有机酸和生育酚等代谢物含量、脂肪酸组成以及抗氧化活性均存在显著差异[6-7]。同时，为了缩短生产周期，满足市场需求，工业发酵豆豉往往选择保温发酵，发酵温度的选择可以改变豆豉挥发性物质强度和发酵菌群的真菌多样性[8-9]。氨基酸态氮是指以氨基酸形式存在的氮元素，其含量可以影响豆豉品质从而判断豆豉的发酵程度[10]，在许多行业标准中作为评价豆豉产品质量是否合格的一个重要理化指标。发酵过程中，细菌型豆豉的氨基酸态氮含量会不断增大至最大值，之后增长速率减小并略有下降趋势[11]。发酵终点的判定直接影响最终产品的品质，但在实际生产中，豆豉发酵终点的判定往往根据工人的个人经验，这导致产品质量参差不齐。研究表明，动力学研究能较好地拟合食品加工过程中代谢物含量变化并建立模型，可为工业生产提供理论基础[12-13]。

本研究利用修正后的Gompertz方程对4 种不同大豆品种发酵得到的细菌型豆豉在不同后发酵温度下的氨基酸态氮含量进行拟合，采用多项式拟合预测其发酵终点；测定其发酵过程中水分、pH值、总酸的变化，利用相关性分析探究不同大豆品种之间品质指标的相关性；测定发酵终点时其游离氨基酸含量，探究大豆品种和温度对豆豉滋味的影响。本研究可为细菌型豆豉生产提供一定理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

4 种常见市售大豆：渝豆6号（LS）（重庆本地大豆）重庆市永辉超市；东生7号（DBL）（东北大粒大豆）、青仁乌（BS）（黑豆） 黑龙江省大兴安岭市当地超市；东生1号（DBS）（东北小粒大豆） 黑龙江省哈尔滨市当地超市；食盐、生姜、辣椒 重庆市永辉超市；枯草芽孢杆菌 上海贺普实业有限公司。

18 种氨基酸标准品（纯度≥98%）：天冬氨酸（Asp）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、苏氨酸（Thr）、甘氨酸（Gly）、赖氨酸（Lys）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）、缬氨酸（Val）、胱氨酸（Cys-Cys）、苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）、半胱氨酸（Cys）、酪氨酸（Tyr）、蛋氨酸（Met） 美国Sigma-Aldrich公司；NaOH标准溶液 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醛溶液、2,4-二硝基氟苯、乙腈（均为色谱级） 四川省成都市科隆化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

1260高效液相色谱仪 美国安捷伦科技公司；FS-2可调高速匀浆机 江苏金坛科析仪器有限公司；LHS-150CLY恒温恒湿箱 上海齐欣科学仪器有限公司；RCT Basic Package磁力搅拌器 德国IKA公司；PB-10 pH计德国赛多利斯科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 细菌型豆豉的制备

大豆筛选→浸泡（25 ℃，12 h）→沥干→蒸煮（常压蒸煮，2 h）→冷却→接种（以蒸煮后大豆质量计，0.05%枯草芽孢杆菌，m/m）→制曲（37 ℃、相对湿度85%，33 h）→拌料（以制曲后的曲料质量计，8%食盐、5%辣椒、10%生姜、50%无菌水，m/m）→后发酵（15、25、40 ℃）→成品豆豉

将拌料步骤中混合均匀的曲料分装在无菌密封袋中。细菌型豆豉的工业生产中，通常会在20～25 ℃间的某一温度下进行保温后发酵，最低不低于15 ℃，最高不高于40 ℃，故选择将密封袋分别放入15、25 ℃及40 ℃的恒温箱中进行后发酵，定时取样并进行相关理化指标的测定。

1.3.2 水分含量的测定

按照GB 5009.3—2016《食品中水分的测定》的直接干燥法[14]进行测定。

1.3.3 pH值的测定

参考刘敏等[15]的方法。取5 g研磨至无明显颗粒的样品到50 mL离心管中，加入40 mL纯水，用匀浆机破碎混匀。7500 r/min离心10 min，将上清液移至50 mL容量瓶并定容，用校正后的pH计进行测定。

1.3.4 总酸含量的测定

取5 g研磨至无明显颗粒的样品到100 mL离心管中，加入50 mL纯水并用匀浆机分散均匀，移至100 mL容量瓶并定容。过滤后取20 mL滤液，按照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》的酸碱滴定法[16]进行测定，结果以乳酸计。

1.3.5 氨基酸态氮的测定

按照1.3.4节的步骤处理样品，按照GB 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》的酸度计法[17]进行测定。

1.3.6 游离氨基酸的测定

参考王迪等[18]的方法处理样品，参照赵英莲等[19]的方法进行游离氨基酸的柱前衍生，设置高效液相色谱条件。

1.3.7 氨基酸态氮的生成动力学模型

使用修正后Gompertz方程拟合4 种细菌型豆豉在3 种后发酵温度下的氨基酸态氮含量，修正后Gompertz方程如下式所示：

式中：P t为后发酵td 的氨基酸态氮含量/（g/100 g）；Pm为氨基酸态氮的最大值/（g/100 g）；tz为滞后时间/d；km为生成速率/（g/h）；e为自然对数的底数（2.718）；t为后发酵时间/d。

1.3.8 Arrhenius模型分析

使用Arrhenius 方程拟合氨基酸态氮生成速率（km/（g/h））与后发酵温度（T/K）的关系，方程如下式所示：

式中：A0为指前因子/（m2/s）；Ea为活化能/（J/mol）；R为气体常数（8.314 J/（mol·K））。

1.4 数据处理

使用Minitab 182018、Origin 2018b软件绘图，使用Microsoft Excel 2019软件进行多项式拟合分析，使用IBM SPSS 25软件进行差异显著性分析和线性回归分析，每个变量的样本间差异采用方差分析和Duncan法确定，使用判定系数（R2）对数学模型进行评估，残差平方和（sum of squared errors，SSE）表示Gompertz方程预测的准确度。

2 结果与分析

2.1 不同细菌型豆豉的氨基酸态氮生成动力学差异

如图1所示，4 种细菌型豆豉在3 种后发酵温度下的氨基酸态氮含量变化均随后发酵的进行呈先上升再略有下降的趋势，其生成速率随后发酵的进行逐渐降低，这与Liu Xiaoyan[20]和赵欣[21]等的研究结果一致。氨基酸态氮的生成与制曲阶段微生物代谢积累的蛋白酶密切相关，蛋白酶将大豆蛋白降解为氨基酸、多肽等小分子物质，使后发酵阶段前期氨基酸态氮含量迅速增加[22]。但随着后发酵的进行，蛋白酶不断被枯草芽孢杆菌和可能存在的乳酸菌、肠杆菌等细菌消耗[23]，生成速率开始降低，导致后发酵阶段后期，氨基酸态氮的生成速率低于消耗速率，出现下降趋势。

图1 不同细菌型豆豉在不同温度下的氨基酸态氮含量实测值与预测值Fig.1 Measured and predicted values of amino nitrogen content in different bacterial-type douchi at different post-fermentation temperatures

由表1可知，R2均大于0.96，说明Gompertz方程可以很好拟合不同温度下后发酵过程中氨基酸态氮的生成动力学。4 种细菌型豆豉在15 ℃后发酵温度下的Pm值为DBL＞LS＞DBS＞BS，在25 ℃和40 ℃后发酵温度下的Pm为LS＞DBL＞DBS＞BS；3 种黄豆型豆豉（LS、DBL和DBS）在15 ℃和25 ℃的Pm没有显著差异（P＞0.05），在40 ℃下，LS与DBS的Pm存在显著差异（P＜0.05）；黑豆型豆豉（BS）在各温度下的Pm均显著低于其他3 种黄豆型豆豉（P＜0.05）。根据细菌型豆豉的行业标准，氨基酸态氮含量需超过0.3 g/100 g，3 种黄豆型豆豉均符合标准，而黑豆型豆豉并未达到该标准（图1）。由于不同大豆的营养成分不同，枯草芽孢杆菌对其利用程度不同。由表2可知，黑豆型豆豉的中性蛋白酶活力低于黄豆型豆豉，这使得黑豆型豆豉的氨基酸态氮含量较低，与程甲[24]的研究结果一致。另外，从宋军霞[25]的研究结果可知，黑豆型豆豉的活菌数远低于黄豆型豆豉，且黏液稀薄，这说明黑豆作为发酵原料，并不利于枯草芽孢杆菌的生长。此外，枯草芽孢杆菌是一个适合在37 ℃生长的菌株，温度的升高促进了芽孢杆菌的生长，蛋白酶生成速度增加，使得4 种豆豉呈现一致的趋势：Pm和km均随着温度的升高而增加（表1）。在课题组先前的研究[18]中得知Pm与后发酵温度T的关系可以用Arrhenius方程进行描述，本研究使用线性回归描述Pm和T的关系。如表3所示，在15～40 ℃范围内，Pm与T有良好的线性关系，km与T的关系符合Arrhenius方程。

表1 Gompertz方程系数及拟合优度Table 1 Coefficients and goodness of fit of Gompertz equation

表2 4 种不同品种大豆原料和制曲后的基本指标（均为干基）Table 2 Basic indexes of four different soybean varieties and douchi koji made from them (on a dry matter basis)

表3 Pm和T的线性回归方程以及km和T的Arrhenius方程拟合Table 3 Linear regression equation of Pm versus T and Arrhenius equation of km versus T

为了精确不同温度下4 种细菌型豆豉后发酵过程的终点，使用多项式拟合后发酵中后期氨基酸态氮含量，推算出氨基酸态氮最高点对应的发酵时间。由表4可知，多项式可以很好地拟合后发酵中后期氨基酸态氮含量变化（R2≥0.91），4 种细菌型豆豉在25、15 ℃和40 ℃后发酵温度下的预测发酵终点均分别为发酵9、10 d和4 d左右。由表5可知，细菌型豆豉的T和t呈负相关线性关系（R2≥0.90），即后发酵温度越高，其发酵结束时间越短。

表4 细菌型豆豉后发酵中后期氨基酸态氮含量的多项式拟合Table 4 Polynomial fitting of amino nitrogen content in bacterialtype douchi at the mid-late stages of fermentation as a function of postfermentation temperature

表5 细菌型豆豉后发酵结束时间和温度之间的关系Table 5 Relationship between the post-fermentation endpoint of bacterial-type douchi and temperature

2.2 不同细菌型豆豉的水分含量、pH值及总酸含量的变化

如图2～4所示，4 种细菌型豆豉在不同后发酵温度下的水分含量、pH值及总酸含量呈现出相似的变化趋势：3 种温度下细菌型豆豉的水分含量整体呈先上升后逐渐平稳的趋势，且无明显差异（图2），这与Tan Yue等[26]的研究结果一致。前期水分上升是由后发酵过程中加入无菌水引起，随后发酵的进行豆豉吸收足够水分后水分含量无明显的波动。3 种温度下细菌型豆豉的总酸含量整体随后发酵的进行而不断上升然后趋于稳定，导致pH值整体随后发酵的进行而不断降低（图3、4），在刘敏等[15]的研究中得到相同的结果。pH值的下降和总酸含量的上升是因为在后发酵期间乳酸菌等微生物[23]分泌出相关酶分解大豆中的大分子物质，从而导致有机酸、氨基酸、脂肪酸等酸性物质增加[27]；随着酸度不断上升，相关水解酶的活力被抑制，导致总酸含量趋于平缓[28]。同时，总酸含量随着发酵温度的升高而增加（图4），这可能是因为在本实验的温度范围内，温度升高促进了芽孢杆菌和乳酸菌的生长繁殖，生成相关酸性物质的酶活力上升，从而导致总酸含量增加。此外，4 种细菌型豆豉中，BS型豆豉的pH值整体较低，这会使分解酶受到抑制、微生物多样性减少[29]，可能导致有机酸类物质生成减少、总酸含量整体较低。

图2 不同细菌型豆豉的水分含量变化Fig.2 Changes in moisture content of different bacterial-type douchi during post-fermentation at different temperatures

图3 不同细菌型豆豉的pH值变化Fig.3 pH changes of four bacterial-type douchi during postfermentation at different temperatures

图4 不同细菌型豆豉的总酸含量变化Fig.4 Changes in total acidity of four bacterial-type douchi during post-fermentation at different temperatures

2.3 不同细菌型豆豉的游离氨基酸含量变化差异

测定4 种细菌型豆豉发酵前及发酵终点时（15、25 ℃发酵10 d及40 ℃发酵4 d）的游离氨基酸含量。如表6所示，4 种细菌型豆豉均检测出17 种游离氨基酸，其中均主要以Glu、Arg和Leu为主，这与索化夷等[30]的研究结果一致。对比4 种细菌型豆豉发酵前后总游离氨基酸的含量，观察到一致的趋势：3 种温度下发酵后的豆豉游离氨基酸总含量均高于发酵前，后发酵温度越高，其游离氨基酸总含量越高，这可能是因为本研究后发酵温度范围内，温度越高，蛋白酶活力越强。相对于发酵前的游离氨基酸总含量，40 ℃下4 种细菌型豆豉（LS、DBL、DBS、BS）分别增加了1.63、2.90、1.67、2.02 倍。其中，细菌型豆豉中如Lys、Ala等部分氨基酸含量在发酵温度上升时，呈现略有下降的趋势，这可能是由于该温度下芽孢杆菌和乳酸菌等微生物的繁殖被促进，从而加快风味物质生成和美拉德反应对氨基酸的消耗，使氨基酸含量下降[31-32]。

表6 不同细菌型豆豉不同温度下发酵前后游离氨基酸含量Table 6 Contents of free amino acid before and after post-fermentation of different bacterial-type douchi at different temperatures

对比3 种黄豆（LS、DBL、DBS）和黑豆（BS）在不同后发酵温度下的游离氨基酸总含量，发现同一温度下3 种黄豆的游离氨基酸总含量均明显高于黑豆，这与氨基酸态氮含量结果一致。通过对比发酵前后4 种细菌型豆豉的必需氨基酸总含量变化，发现4 种细菌型豆豉除DBL在15 ℃发酵后的必需氨基酸总含量相比于发酵前略有下降以外，其余均高于发酵前的必需氨基酸总含量，且随着后发酵温度升高，必需氨基酸总含量也随之升高。

按照Merlo等[33]的研究将游离氨基酸分为鲜味（Asp、Glu）、甜味（丝氨酸、Gly、Thr、Ala）、苦味（Arg、Met、Val、Leu、Ile、His、Phe、Tyr）、无味（Pro、Cys、Lys）4 类呈味氨基酸。由表7可知，4 种细菌型豆豉呈现一致的趋势：发酵后，苦味氨基酸比例降低，而鲜味氨基酸比例升高，这与Han等[34]的研究结果一致。但相比于15 ℃后发酵温度，后发酵温度为40 ℃时所得的4 种细菌型豆豉均出现鲜味氨基酸比例降低，而苦味氨基酸比例增加。发酵过程中，氨基酸在蛋白酶作用下不断生成，但其同时作为风味物质的前体和美拉德反应的反应物也被消耗[35]，从韩佳冬[36]的研究可知，美拉德反应主要是对鲜味氨基酸的消耗。因此，推测在本研究温度范围内，温度的升高促进了美拉德反应对鲜味氨基酸的消耗，使鲜味氨基酸比例降低，苦味氨基酸比例上升。

表7 不同温度下不同细菌型豆豉发酵前后呈味氨基酸在总氨基酸中的占比Table 7 Ratio of flavor to total amino acids before and after post-fermentation of different bacterial-type douchi at different temperatures

mg/g

2.4 不同细菌型豆豉各理化指标的相关性分析

对4 种细菌型豆豉在不同温度下后发酵过程中的水分含量、pH值、总酸及氨基酸态氮含量进行相关性分析。

由图5可知，4 种细菌型豆豉中各指标间的相关性呈相似的趋势：4 种细菌型豆豉中发酵温度与总酸含量均呈极显著正相关（P＜0.01），这可能是因为本研究温度范围内，温度升高不仅促进了枯草芽孢杆菌和乳酸菌等微生物的生长代谢，同时，生成有机酸、脂肪酸及氨基酸等酸性物质的酶活性升高。除BS中水分含量与总酸含量为显著正相关（P＜0.05）外，其余3 种细菌型豆豉均呈极显著正相关（P＜0.01）。LS和DBS中水分含量与氨基酸态氮含量呈显著正相关（P＜0.05），而DBL和BS中呈极显著正相关（P＜0.01）。LS和DBL中pH值与总酸含量呈显著负相关（P＜0.05），在DBS和BS中呈极显著负相关（P＜0.01）。LS和BS中pH值与氨基酸态氮含量呈显著负相关（P＜0.05），在DBL和DBS中呈极显著负相关（P＜0.01）。这可能是因为后发酵过程中，水分含量逐渐增加至饱和，pH值不断降低，总酸和氨基酸态氮含量不断上升。此外，4 种细菌型豆豉中总酸含量与氨基酸态氮含量均呈极显著正相关（P＜0.01），总酸和氨基酸态氮的生成均与豆豉中微生物的代谢密切相关，发酵过程中，微生物生长旺盛时，产酸和分解蛋白质能力强，总酸和氨基酸态氮含量随之增加，而总酸升高到一定值时反而会抑制微生物的生长以及蛋白酶活力，使氨基酸态氮生成速度下降，总酸和氨基酸态氮含量趋于平缓。

图5 不同指标间的相关性分析Fig.5 Correlation analysis between different physicochemical indicators

3 结论

采用修正后Gompertz方程很好地拟合了4 种细菌型豆豉（LS、DBL、DBS、BS）在3 个不同后发酵温度下（15、25 ℃和40 ℃）的氨基酸态氮生成动力学（R2＞0.96），3 个不同温度下（25、15 ℃和40 ℃）拟合的预测发酵终点分别为9、10 d和4 d左右。Pm和km均随着温度的升高而升高，且Pm与T呈线性关系，km与T的关系符合Arrhenius方程。此外，同一温度下，3 种黄豆型豆豉LS、DBL、DBS的氨基酸态氮含量和游离氨基酸含量没有明显差异，但明显高于黑豆型豆豉；根据豆豉的行业标准，其氨基酸态氮含量需超过0.3 g/100 g，而黑豆型豆豉并未达到该标准。从测定的游离氨基酸含量可知，发酵使细菌型豆豉的鲜味氨基酸比例上升，而苦味氨基酸比例下降；但相比于15 ℃后发酵温度，后发酵温度为40 ℃时所得的4 种细菌型豆豉均出现鲜味氨基酸比例降低，而苦味氨基酸比例增加，说明过高的后发酵温度会增加豆豉的苦味。

本研究结果能准确描述不同温度下4 种细菌型豆豉氨基酸态氮变化的动力学方程，明确了温度和大豆品种对细菌型豆豉理化性质的影响，为细菌型豆豉的工业化生产提供一定理论支持，但还未对温度和大豆品种对细菌型豆豉挥发性物质的影响进行探究。黄豆型和黑豆型豆豉在氨基酸态氮和游离氨基酸含量上存在明显差异，这与前人研究结果[24-25,37]一致，但其根本原因还未明确。因此，后续研究可以通过从大豆自身的种皮、结构、基因型方面的相同点和差异性探究其对发酵细菌型豆豉品质的影响。