乳清分离蛋白纤维和典型抗氧化剂对罗伊氏乳杆菌TMW 1.656在常温贮藏胁迫下存活的影响

郭前婉，王 琪，严文莉，张运艳，康 旭，赵 萌,

（1.湖北工业大学 发酵工程教育部重点实验室，国家“111”细胞调控与分子药物学中心，湖北 武汉 430068；2.上海良友（集团）有限公司技术中心，上海 200333）

益生菌是一种可以为人类宿主健康带来有益影响的功能性产品，如免疫调节、降低良性肿瘤和恶性肿瘤的风险、治疗胃部不适、对抗致病菌和减轻高血压等[1]。益生菌的干态化可以有效延长保质期，降低低温贮存的成本，还可以方便食品应用。喷雾干燥可以通过将液体产品雾化在热气体中，使其瞬间形成粉末，与冷冻干燥相比，具有成本低、生产率高、连续性好、加工速度快等优点，是最常用的益生菌干燥技术之一[2]。但喷雾干燥过程中施加的高温、渗透胁迫、脱水和氧暴露等不良因素，会造成益生菌的膜成分、胞内蛋白质、核糖体、DNA和RNA的损伤，进一步加速益生菌死亡[2]。然而，联合国粮农组织及世界卫生组织指出，食用时活菌数必须达到一定数值，最终才能在胃肠道中发挥重要作用[3]。因此，需要探索适合益生菌喷雾干燥的壁材组分，以改善益生菌喷雾干燥存活。

乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）主要由β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、牛血清白蛋白和免疫球蛋白组成，因其成本低、营养价值高而被广泛应用于食品行业[4]，且被证实可以有效保护益生菌[5-6]。乳清分离蛋白纤维（whey protein isolate fibrils，WPIF）是WPI在酸性、高温以及低离子强度下长时间加热自组装形成的一种新型纳米材料[7]，具有较多独特特性，如高长径比、高抗氧化性和高疏水性[8-9]。WPIF已被广泛报道具有较高的抗氧化性[10]，如Mohammadian等[11]发现与WPI相比，WPIF的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力提高3.3 倍；Zhao Yiguo等[12]发现0.5% WPIF 2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基清除活性可达到80%。目前，关于WPIF抗氧化性的应用已被广泛研究，如在涂膜实验中可有效抑制苹果褐变[13]、在油脂荷载实验中可有效降低油脂氧化[14]以及提高D-柠檬烯的抗氧化性[15]等。因WPIF具有较高的抗氧化性，设想WPIF会有利于益生菌的抗氧化胁迫存活，而目前还未有研究将WPIF应用到益生菌保护中。

抗氧化剂是一种能够延迟或防止底物由于氧化而发生风味恶化的物质[16]，在益生菌基质中添加抗氧化剂可以有效降低益生菌的死亡率。表没食子酸儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是典型的多酚类抗氧化剂，有文献报道其可以有效改善益生菌贮藏存活[17-19]，也有研究发现EGCG在贮藏期间对益生菌存活影响不大[20]。还有研究指出EGCG具有抑菌性以及广泛的抑菌谱[21-22]，其氧化产物可与核酸结合，会对细胞造成伤害[23]。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一种内源性抗氧化剂，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成[24]，目前没有关于GSH对益生菌的影响研究，只有相关报道发现L-半胱氨酸的保护作用具有菌株特异性[25]。因而，有必要进一步核实典型抗氧化剂EGCG和GSH在益生菌喷雾干燥和常温贮藏中是施加保护效果还是抑菌效果。本实验对WPIF的制备条件进行优化，通过喷雾干燥的方法制备益生菌粉，并比较不同壁材中罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）TMW 1.656在常温贮藏的存活情况，以探究新型纳米材料WPIF和抗氧化剂EGCG/GSH质量浓度对菌体的存活影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

WPI 美国Davisco Foods International有限公司；罗伊氏乳杆菌TMW 1.656 加拿大阿尔伯塔大学食品微生物实验室；EGCG 上海源叶生物科技有限公司；GSH上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

小型喷雾干燥机 郑州宏朗仪器设备有限公司；JSM-6390lv低真空扫描电镜、JEM-1400Plus透射电镜 日本电子株式会社；AIRTECH超净工作台苏州安泰空气技术有限公司；Direct Q3型超纯水机美国Merck Millipore公司；F-7000荧光分光光度计日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 WPIF的制备优化

WPIF按照Hu Jing等[26]的方法制备并作了一些修改。通过将WPI粉末溶解在无菌水中，并在25 ℃搅拌2 h制备30 g/L WPI溶液，用6.0 mol/L盐酸调节到pH 2，并在75、80、85、90、95 ℃加热10 h，得到WPIF溶液在冰水混合物中冷却20 min，研究温度对WPIF的影响；在确定温度的基础上，其余条件不变，研究pH值（1.6、1.8、2.0、2.5、3.0）对WPIF形成的影响；在确定温度和pH值的基础上，其余条件不变，研究WPI质量浓度（10、20、30、40、50 g/L）对WPIF形成的影响。

1.3.2 WPIF的表征

1.3.2.1 透射电镜观察

按照Hu Jing等[26]方法使用透射电镜观察WPIF样品的微观结构。将10 μL 0.3 g/L的蛋白质溶液移到铜网上干燥，观察前用磷钨酸（15 g/L，将磷钨酸粉末溶解在超纯水中，并在水浴中以100%的功率超声处理30 min，0.22 μm水系滤头过滤）染色3 min，再用滤纸吸走多余的染料。

1.3.2.2 硫磺素-T（thioflavin T，ThT）荧光强度的测定

按照Mohammadian等[11]ThT荧光强度法检测WPIF的形成。在3 mL蛋白质溶液中加入20 μL ThT溶液（12 g/L，将ThT粉末溶解在超纯水中并用0.22 μm水系滤头过滤），并在黑暗中于25 ℃放置1 min，然后在荧光分光光度计上测定。激发和发射波长分别为450 nm和482 nm。

1.3.3 菌种培养及菌样制备

菌种培养按照Huang Xue等[27]的方法。将罗伊氏乳杆菌TMW 1.656以2%的接种量接种于改良mMRS液体培养基中，37 ℃培养24 h；然后以4.0%接种量转入新的mMRS液体培养基，并在37 ℃培养24 h；将培养液10000×g离心10 min，用蛋白胨盐溶液（peptone saline，PS，1.0 g/L蛋白胨，8.5 g/L NaCl，pH 6.8）洗涤2 次，并重新悬浮在5.0 mL PS溶液中，制备得到约109CFU/mL的菌悬液。

1.3.4 EGCG和GSH的抗菌性评价

将EGCG和GSH粉末溶于30 mL PS溶液中，制备5.0 g/L的EGCG/GSH溶液，并在25 ℃搅拌10 min。然后，加入0.6 mL 9（lg（CFU/mL））的菌悬液，在300 r/min下搅拌10 min。最后将混合溶液在37 ℃培养1～6 h，同时将在PS中培养相同时间的菌悬液作为对照。通过10 倍的连续稀释，涂布在mMRS固体培养基上，并在37 ℃倒置培养48 h，对混合溶液中的活细胞进行计数，其细胞失活量表示为ΔNanti，并按式（1）计算：

式中：N1为培养前活细胞的初始数量；N2为在EGCG/GSH中培养后的活细胞数量；N3为在PS中培养相同时间的活细胞数量。

1.3.5 喷雾干燥菌粉的制备

6 组益生菌粉（WPI、WPIF、WPI+0.5 mg/mL EGCG、WPI+5.0 mg/mL EGCG、WPI+0.5 mg/mL GSH和WPI+5.0 mg/mL GSH）的制备方法如下：首先，配制WPI溶液，即将WPI粉末溶解在无菌水中并在25 ℃搅拌2 h，其终质量浓度为30 g/L；接着，配制WPIF溶液，即将30 g/L的WPI溶液，用6.0 mol/L盐酸将溶液调pH 2.0，并在80 ℃加热10 h，最后，取出样品并立即在冰水中冷却20 min制备得到。取50 mL制备好的WPI或WPIF溶液，用1.0 mol/L或6.0 mol/L的NaOH溶液调节到pH 6.8，再加入1 mL细胞悬液和1.0 g蔗糖，制备WPI或WPIF的益生菌混合溶液。在WPI或WPIF的益生菌混合溶液中，添加至最终质量浓度为0.5 mg/mL和5.0 mg/mL的EGCG或GSH，300 r/min搅拌10 min，制备含抗氧化剂EGCG和GSH的益生菌混合溶液。将各菌体混合溶液进行喷雾干燥，进口温度120 ℃，出口温度80 ℃。

1.3.6 喷雾干燥菌粉的形态观测

使用扫描电镜对喷雾干燥益生菌粉末进行成像[27]。在成像之前，将样品粘在胶布上并镀金。所有样品的放大倍数为2000 倍，加速电压为10 kV。

1.3.7 喷雾干燥菌粉的失活计算

菌体失活按照Zhao Meng等[28]的报道进行测定。将10 mg的新鲜喷雾干燥益生菌粉末加入990 mg PS溶液中，然后在37 ℃孵育10 min，并涡旋30 s进行分散。通过10 倍的连续稀释，在mMRS固体培养基上涂布，并在37 ℃倒置培养48 h。贮藏实验是将喷雾干燥菌粉在30 ℃和相对湿度33%条件下贮存，在固定的时间间隔内对样品进行细胞计数。菌体失活情况以ΔNs表示，并按式（2）计算：

式中：N0为菌悬液的活细胞数；Nt为贮存td后喷雾干燥菌粉的活细胞数。

1.3.8 高温处理后WPIF的微观结构观察

首先，制备得到WPIF溶液，并将pH值调至6.8左右备用。再将pH 6.8的WPIF溶液放置进入100 ℃水浴锅中加热1 min，稀释后取10 μL溶液到铜网上。最后进行透射电镜观察。

1.4 数据处理与分析

采用SPSS 23.0软件和Excel 2019进行统计分析。通过独立样本T检验确定抗氧化剂的抗菌性评价；单因素方差分析确定喷雾干燥以及常温贮存期间益生菌失活的差异显著性（P＜0.05，差异显著）。使用简单线性回归分析菌体贮藏期间失活情况和贮藏时间之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 WPIF的制备优化

温度会影响稳定蛋白质结构力的平衡，如内部氢键、范德华相互作用和疏水相互作用等，从而使得蛋白质发生热变性[29]。由图1可知，当温度达到85 ℃以后，蛋白溶液呈现出轻微的黄色，这可能是原材料WPI中含有少量的糖类，在高温长时间加热的条件下，发生了焦糖化反应。在75～95 ℃条件下加热都可以形成长而纤细的纤维，且形态上没有差异（图2A）。由图3A可知，随着温度的升高，其ThT荧光强度呈现先上升后降低的趋势，在80 ℃达到顶峰。与之类似，也有研究发现在高温下长时间加热会进一步导致纤维的破坏，如pH 2、1%的β-乳球蛋白在110 ℃加热5 h和120 ℃加热3.3 h后荧光强度都显著降低[30]。因此，选取80 ℃为最优条件进行后续实验。

图1 WPI溶液在75～95 ℃加热10 h的宏观图片Fig.1 Macrophotographs of WPI solutions heated at 75–95 ℃ for 10 h

图2 WPIF的透射电镜图片Fig.2 TEM micrographs of WPIF

图3 WPIF的ThT荧光强度Fig.3 ThT fluorescence intensity of WPIF

pH值在蛋白纤维化过程中会影响肽键的断裂和静电相互作用的调节[31]。有研究发现β-乳球蛋白在pH 1.6～3.0形成的纤维较长，而在pH 3.5时形成的纤维较短[14]。由图2B可以观察到，在本实验中pH 1.6～1.8的纤维呈现出弯曲状，pH 2.0～3.0的纤维直而纤细。由图3B可知，随着pH值的升高，其ThT荧光强度呈现先上升后降低的趋势，在pH 2.0达到顶峰。因此，选择pH 2.0为最优条件进行下一步实验。

蛋白质量浓度也能影响原纤维的形态，有研究发现在80 ℃、pH 2.0条件下加热β-乳球蛋白16 h，添加量为3%时可形成长半柔性纤维，而7.5%时形成的是短蠕虫状纤维[32]。此外，为了确保纤维的形成，蛋白质量浓度需要达到临界纤维化浓度[33]，因此，本研究对30～50 g/L的蛋白质量浓度进行优化。30～50 g/L的WPI都能够形成纤维（图2C），且随着质量浓度的升高，荧光强度逐渐增大（图3C）。然而质量浓度越高，蛋白溶液越稠，考虑到其实际应用，选择质量浓度30 g/L进行后续实验。因此，后续制备益生菌喷干菌粉的实验中选取pH 2.0、30 g/L的WPI在80 ℃加热10 h制备WPIF。

2.2 EGCG和GSH的抑菌性

有文献报道有些抗氧化剂具有抑菌性，如多酚类[22,34]，且在本实验中抗氧化剂和细胞在制备和贮存期间会直接接触，因此，在进行包埋实验前评估EGCG和GSH对罗伊氏乳杆菌的抗菌活性。研究发现，罗伊氏乳杆菌TMW 1.656和EGCG/GSH在37 ℃共培养1 h后，活细胞数量没有明显变化，如含EGCG的细胞悬液仅失活0.06±0.02，而含GSH的细胞悬液失活数量为负值（表1），这是因为使用的平板技术法存在一定的误差。因此，这也表明在微囊的制备过程中，抗氧化剂不会对细胞造成额外的损害。然而，在共培养6 h后，添加EGCG和GSH的混合液中菌体失活值分别为0.70±0.02和2.73±0.10，这表明细胞与EGCG/GSH长时间的接触显著加速了细胞的死亡，并且GSH的抑菌性显著大于EGCG。

表1 罗伊氏乳杆菌TMW 1.656与EGCG/GSH共培养后益生菌的失活情况Table 1 Inactivation of L.reuteri TMW 1.656 after incubation in EGCG or GSH solution

2.3 喷雾干燥菌粉的表观形态

如图4所示，喷雾干燥形成的都是微米级球状体，且大小大多分布在10～20 μm。喷雾干燥菌粉的球体表面光滑，但有一定程度的凹陷，这可能是由于喷雾干燥的高温使微囊内部水分快速蒸发造成的。与之类似，Zhao Meng等[35]利用喷雾干燥制备的A型明胶/阿拉伯胶/蔗糖益生菌微囊的形态也是光滑且有一些空洞，大小在3～20 μm左右。

图4 WPI、WPIF以及添加 EGCG/GSH喷雾干燥菌粉的扫描电镜照片Fig.4 SEM photographs of spray dried probiotic powders with WPI,WPIF or WPI+EGCG/GSH

2.4 喷雾干燥菌粉的失活量和贮藏失活量

由表2可知，喷雾干燥造成菌体部分死亡，WPI和WPIF组中菌体失活量分别为0.25±0.22和0.14±0.13，两种壁材包埋的菌体喷雾干燥死亡数量没有显著差异。且喷雾干燥菌粉在常温贮藏28 d之后，WPI和WPIF组中菌体失活量均在1.40左右，这表明喷雾干燥菌粉在常温贮藏过程中，WPI与WPIF保护效果相似，也就是说WPIF并没有为喷雾干燥菌粉提供额外的保护。

表2 喷雾干燥以及常温贮藏（30 ℃、相对湿度33%）后益生菌的失活情况Table 2 Probiotic inactivation after spray drying and during ambient storage at 30 ℃ and relative humidity of 33%

为了说明抗氧化剂质量浓度在喷雾干燥和常温贮存期间对细胞活力的影响，在WPI基质中分别加入0.5 mg/mL和5.0 mg/mL的EGCG/GSH。与含0.5 mg/mL抗氧化剂相比，含5.0 mg/mL抗氧化剂的菌体失活量更高；如在贮藏28 d后，WPI+0.5 mg/mL EGCG组菌体失活量为1.59±0.02，而WPI+5.0 mg/mL EGCG组菌体失活量为3.02±0.19。且与含EGCG（WPI+0.5 mg/mL EGCG，WPI+5.0 mg/mL EGCG）相比，含GSH组（WPI+0.5 mg/mL GSH，WPI+5.0 mg/mL GSH）的菌体失活量明显更高。总之，益生菌的贮藏稳定性遵循WPIF≈WPI＞WPI+0.5 mg/mL EGCG＞WPI+0.5 mg/mL GSH＞WPI+5.0 mg/mL EGCG＞WPI+5.0 mg/mL GSH的顺序，并表明EGCG和GSH的存在不利于的益生菌存活，GSH对菌体的伤害比EGCG更大，且具有浓度依耐性，即抗氧化剂浓度越高，对菌体伤害越大。

为了进一步比较抗氧化剂种类以及质量浓度对喷雾干燥菌粉中菌体的存活影响，本研究对其贮藏存活进行拟合，计算不同种类和质量浓度抗氧化剂基质中菌体的贮藏失活常数，即菌体死亡速率的大小。如表3所示，喷雾干燥菌粉在常温贮藏的失活常数顺序为kWPI+5.0mg/mLGSH＞kWPI+5.0mg/mLEGCG＞kWPI+0.5mg/mLGSH＞kWPIF≈kWPI≈kWPI+0.5mg/mLEGCG，表明在贮藏过程中，抗氧化剂GSH比EGCG对菌体的伤害更大，且抗氧化剂质量浓度越高，菌体死亡的速度越快。

表3 喷雾干燥菌粉的菌体失活常数Table 3 Inactivation constants of spray-dried probiotic powders

有研究表明EGCG可以改善菌体存活，也可能对菌体没有影响[20,36-37]，这可能是由不同贮存条件或菌种差异造成。如在4 ℃的苹果汁中贮存30 d后，WPI-EGCG共轭物保护的益生菌存活率显著提高[36]；在4 ℃的5%无菌氯化钠溶液中贮存30 d后，含10%绿茶提取物的由壳聚糖包裹的海藻酸盐微胶囊只略微提高了益生菌存活率[37]；而含有10 g/L EGCG的喷雾干燥海藻酸盐微胶囊在4 ℃贮存12 d后并没有改善菌体存活[20]。EGCG会抑制微生物生长[22,34]，且其自氧化产物还会对细胞造成损害[38-39]，而本研究贮藏实验在30 ℃、相对湿度33%条件下进行，在恶劣环境下可能会进一步加速EGCG的氧化，并诱发更多的细胞失活，这可能是EGCG在常温贮藏期间加速益生菌死亡的原因。

目前还鲜有关于GSH对益生菌存活影响的研究。只有报道在相对湿度32%、22 ℃贮藏90 d后发现，添加L-半胱氨酸的喷雾干燥乳清浓缩蛋白菌粉中嗜乳酸杆菌Ki存活率提高，副干酪乳杆菌L26存活率没有变化，动物双歧杆菌B-12存活率降低[25]。在本研究中，常温贮藏中含GSH的基质中益生菌失活量最高，与益生菌在GSH溶液中培养6 h后的失活量最高一致（表1），这也进一步表明长时间与抗氧化剂接触对细胞有害。

2.5 高温对WPIF的影响机制

为了解释WPIF没有改善喷雾干燥菌体存活的原因，利用透射电镜观察了WPIF在喷雾干燥后的变化，将pH 6.8的WPI和WPIF溶液经过短时间高温加热处理（100 ℃、1 min）进行观察。pH 6.8的WPI溶液呈现透明状，而在100 ℃加热1 min之后，溶液变成乳白色（图5A）；pH 6.8的WPIF溶液未加热之前呈现乳白色，并且能观察到纤维状物质，而加热之后WPIF溶液中纤维状消失，形成了大量的聚集物（图5B），这说明WPIF溶液在中性条件下短时间的高温加热会使纤维结构消失和聚集。类似的，有研究发现在4%、pH 2条件下制备纤维，将pH值调至6.8后在90 ℃加热20 min，其纤维结构消失，只能观察到聚集物[40]。而在制备菌粉时，喷雾干燥温度较高，WPIF溶液极有可能是在高温条件下发生了聚集，其纤维结构消失，因此其对益生菌的保护效果与WPI相差不大。

图5 WPI（A）和WPIF（B）溶液经高温处理后的宏观、微观图Fig.5 Macroscopic,microscopic images of WPI (A) and WPIF (B)solutions after high temperature treatment

3 结论

探索了新型纳米材料WPIF以及典型抗氧化剂浓度对喷雾干燥微囊中益生菌存活的影响，益生菌存活实验表明，在喷雾干燥菌粉中，WPI与WPIF两种基质包埋菌体其存活率没有显著差别，这可能是因为高温造成蛋白纤维的聚集和分解，使得WPIF没有发挥其优越性能。为了避免高温对WPIF的结构和特性的破坏，在后续研究中，将考虑尝试在低温条件下利用WPIF的抗氧化特性进行益生菌保护，如湿态体系、冷干和真空干燥等低温方式制备菌粉。添加EGCG/GSH都加速了喷雾干燥菌粉在常温贮藏期间的死亡，这与添加抗氧化剂可以有效保护益生菌免受氧化应激的“常识”相反。且抗氧化剂对菌体的伤害具有浓度依耐性，质量浓度越高，菌体死亡数量越多。EGCG和GSH加速益生菌的死亡可能与它们的抗菌作用和自动氧化产物的毒性有关。如何利用抗氧化剂保护益生菌免受氧化应激的影响而不损害益生菌仍然是未来的一个重要研究方向。