外泌体源性微RNA与肛瘘术后创面愈合的研究进展

陈俊宏，冯文哲

作者单位：1陕西中医药大学第一临床医学院，陕西 咸阳 712000；2陕西中医药大学附属医院肛肠科，陕西 咸阳 712000

肛瘘是指直肠或肛管与周围皮肤相连通形成的瘘管，是肛门直肠间隙感染性疾病的慢性期。手术作为其治疗的首选方案，以瘘管切除术或切开挂线最为常见，将慢性闭合性伤口转化为急性开放性伤口，进而允许愈合级联重新开始，最后进展至完成组织修复。然而，由于肛门部位容易受到细菌的感染，特别是粪便中的大肠杆菌，如何有效地抑制伤口的炎症反应、促进伤口的愈合，就成了术后护理的重要问题［1］。因此，探寻肛瘘术后创面炎症机制、促进创面组织的修复和愈合至关重要。

外泌体是一种在各种体液中广泛分布［2-3］的细胞间信息传输载体，以胞吐的方式分泌，具有膜性囊泡结构，可以包裹DNA、RNA、特定蛋白、脂肪等生物活性物质［4-5］。作为一种具备巨大潜在前景的物质，它已经为众多疾病的诊断、治疗和预后提供了新思路。外泌体通过释放其中生物活性物质，在免疫调节、炎症反应和肿瘤微环境的建立等方面发挥重要作用［6-7］。并且以其为载体的MicroRNA（miRNA）已被各种报道证明，作为一系列生理、病理过程中的参与者，其在众多生物学活动中起着重要的调控作用。故本研究以外泌体源性miRNA 作为研究重点，通过探讨肛瘘术后创面的愈合过程和回顾外泌体、miRNA 的生物学机制，为抑制肛瘘术后创面炎症和促进创面愈合提供新的研究思路。

1 肛瘘创面愈合机制

众所周知，创面愈合是一个复杂的动态生理过程，主要分为3个阶段：炎症期、增殖期和重塑期［8-9］，包括局部炎症反应、细胞增殖及肉芽组织形成和组织重建。这个过程经历结构蛋白与生长因子、蛋白激酶的交互作用，以及修复后细胞的增殖、分化、凋亡等。肛瘘术后创面组织的愈合同样如此，即细胞增殖、胶原基质分泌、纤维形成和肉芽组织再生等环节。据报道，在肛瘘术后创面愈合中起到关键作用的主要是转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）介导的胶原纤维合成和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）介导的新生血管生成［10］。并且有研究报道，内源性TGF-β1、VEGF 在肛瘘术后创面肉芽组织中存在表达，可以提示二者在肛瘘术后创面愈合过程中发挥重要作用［11］。其中，VEGF 是一种促血管化因子，它能促进内皮细胞的增殖、分化和迁移，从而加速血管形成和保持血管的正常状态［12］。而在慢性、难愈合伤口的修复过程中，新生血管是非常重要的，过低的血管化会严重影响肉芽组织新生和上皮再生［13-15］。另外，TGF-β1 是公认的对成纤维细胞具有强效诱导作用的因子，能促进成纤维细胞增殖，刺激分泌胶原纤维，诱导合成细胞外基质蛋白，为肉芽组织的形成创造良好的条件［16］。

除此之外，术后的炎症反应也是创面愈合的重要影响因素，例如白细胞介素（interleukin，IL）-4，一种由Th2 淋巴细胞分泌的细胞因子，诱导机体释放大量的炎症介质，进而引起局部免疫反应的增加［17］。IL-17作为炎症反应的重要指标，可诱导炎症反应因子的聚集，最终加剧炎症反应。肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），是启动机体炎症反应的因子，同样可通过诱导炎症介质聚集，从而诱发炎症反应。不仅如此，在谢昌营等［18］研究中发现，肛瘘模型大鼠创面的肉芽组织中VEGF、低氧诱导因子-1（hypoxia-Inducible Factors-1，HIF-1）、胎盘生长因子（placental growth factor，PLGF）、促血管生成素-Ⅰ（angiopoietin-Ⅰ，Ang-Ⅰ）、促血管生成素-Ⅱ（ang-Ⅱ）等血管生长相关因子表达降低，而IL-1β、IL-2、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等炎症相关因子表达升高。近年来，血管生成、炎症反应等与创面愈合密切相关因素的研究方向正不断向细胞、分子层面深入，这不妨给予一些启示：从细胞间通信、分子机制来解决肛瘘病人术后创面愈合的难题。

2 外泌体简介

2.1 外泌体的来源外泌体，一种纳米级的囊泡，首次被发现于成熟哺乳动物的网织红细胞中，并于1981年由Trams命名［19］。其生物合成涵括了细胞膜内吞形成内体、多囊泡体的合成及释放等过程，牵涉诸多信号分子的调控，具体分子机制尚不完全清楚；但已有研究［20］报道称，在外泌体的分泌过程中，Rab 蛋白家族成员起着重要的调控作用，并且不同类型细胞激活外泌体合成、分泌的方式存在不同。目前可知的是，外泌体主要由哺乳动物分泌，且能稳定存在于血液、尿液、脑脊液等多种体液中，这一优点为它的提取提供了有利条件。

2.2 外泌体的结构外泌体是一种磷脂双分子层的膜性囊泡，内含DNA、RNA、蛋白质等生物活性物质，其中miRNA 的研究目前已成为热点。而外泌体稳定的脂质结构，不仅能保护其内物质不受外界环境的侵扰，并且可以通过特定蛋白的调控，作为miRNA等分子的载体，参与细胞间的通信活动。

2.3 外泌体的生物学特性众多研究表明，不同来源外泌体携带的分子同样具备组织特异性，且病变细胞能比正常细胞分泌更多的外泌体［21］。它的生物学机制主要有以下三种方式：（1）黏附于细胞膜上，以配体-受体的途径激活下游信号通路［22］；（2）将内容物（蛋白、mRNA 及miRNA 等）以不同方式向靶细胞内吞噬中，从而让靶细胞功能和表型变化；（3）将内容物转运到目标细胞的细胞膜上，并于细胞质中发挥作用［23］。此外，外泌体能够诱导炎症反应，例如肿瘤细胞来源的外泌体，能与Toll 样受体（toll like receptors，TLRs）结合，启动核因子-κB（nuclear factor κB，NF-κB）信号通路，进而促进TNF-α、IL-6、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）、CC 趋化因子配体2［Chemokine （C-C motif） ligand 2，CCL2］等炎性因子的分泌［24］。而且Vrijsen 等［25］研究证明，外泌体与组织修复密切相关，干细胞来源外泌体可通过其内细胞外基质金属蛋白酶（matrix metollo proteinases，MMP）诱导因子的高表达，激活细胞外信号调节激酶/蛋白激酶B（extracellular signal-regulated kinase/Protein kinase B，ERK/AKT）信号通路，最终介导血管网的形成和内皮细胞的迁移。

3 miRNA的效应机制

3.1 miRNA 的简介miRNA 是一种18-25bp 长度的非编码RNA，主要通过与靶mRNA 3'端非编码区（3'Untranslated Regions，3'UTR）的互补核苷酸序列结合，抑制靶mRNA 的翻译或降解，从而调控受体细胞的多种生物学过程［26］。近期研究［27-29］显示，miRNA 无论是在炎症反应、细胞增殖、组织重建过程中都有着关键作用。

3.2 miRNA 负性调控炎症反应炎症是机体在受到病原体感染或组织损害时激活的保护性反应，通常伴随着炎性因子的产生以及相关信号通路的活化。其中，CCL2是一种调节单核细胞浸润和迁移的炎症细胞因子，与促炎因子IL-1β 和TNF-α 的表达呈正相关［30］，而在一项有关增生型糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy，PDR）的研究中发现，血清外泌体miR-106能通过降低CCL2表达从而抑制炎症反应和氧化应激反应［31］。不仅如此，与细胞增殖、炎症反应密切相关的NF-κB 信号通路，会诱导一系列细胞因子的表达，进而刺激炎症反应［32-33］；而作为其上游重要调节因子的TLR4，能将细胞外刺激（脂多糖、病毒、炎性细胞）传递到胞内，且通过下游的调控，阻断NF-κB 信号通路的激活，达成与之相反的结果，最终抑制炎症反应。据报道，miR-182-5p 和miR-106a 均能下调TLR4 表达，并通过阻断NF-κB 信号通路的活化，使TNF-α、IL-6、IL-1b等促炎因子的释放减少，起到抑制炎症反应的效果［34-35］。尽管如此，但这一过程不是单向的，有研究表明miRNA 与炎症反应之间存在负性调控，例如由于NF-κB 的激活，miR-9 的表达被上调，同时NFκB 即Nfkb1/p50 亚基又是miR-9 的靶标，因此miR-9能与NF-κB 的mRNA 结合并抑制其翻译，导致NFκB表达减弱［36］，类似的负性调控让炎症反应的调节变得更为精巧。

而且，某些miRNA 调控炎症反应的过程，与DNA 甲基化关联密切。部分炎性因子如IL、TNF-α等均可扰乱DNA 甲基化转移酶（DNA methyltr ansferase，DNMT）的表达，导致异常甲基化，最终影响炎性因子自身的表达，达到调控炎症的目的。而DNMT1表达的下调能引起miR-193a-5p基因激活子区低甲基化，使hsa-miR-193a-5p 表达上调，进而抑制炎症［37］。另外，miRNA也能负性调节DNA甲基化的程度，例如miR-21 以RAS 鸟苷核苷酸释放蛋白1（ras guanyl nucleotide releasing protein 1，RAS GRP1）的途径为靶点，间接抑制DNMT1 的表达，使T 细胞的DNA低甲基化［38］。

3.3 外泌体源性miRNA的应用miRNA的非侵入性和稳定性正成为临床疾病诊断和治疗的新途径。一项有关糖尿病足感染的研究［39］中，病人血清中存在部分miRNA 表达水平的差异，例如miR-155 呈较高表达，但相对的miR-21、miR-132 的表达水平偏低。这一结果说明，在糖尿病足感染慢性炎症的过程中，miR-155 可能发挥促炎作用，而miR-21、miR-132 却是起到抑制炎症的作用。不但如此，通过比较结果的相关性发现，miR-155、miR-21 和miR-132与血小板衍生生长因子BB（platelet derived growth factor BB，PDGF-BB）、碱性成纤维生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）等创面修复因子存在一定相关性，提示上述miRNA 在调节细胞生长因子中起着重要作用，从而促进皮肤的创面愈合。

此外，有研究报道，miRNA-126 对内皮细胞中血管细胞黏附因子1（vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1）的表达存在抑制作用，因此可通过降低miRNA-126 的表达来增强白细胞黏附，最终达到缓解牙周炎症的目的；并且学者通过敲除斑马鱼miRNA-126 基因的研究发现，miRNA-126 还能调控SPRED-1 等牙周炎的相关靶基因进而影响局部血管的生成［40］。

4 外泌体源性miRNA与肛瘘术后创面愈合

4.1 肛瘘愈合的关联因素肛瘘的创面愈合可能与组织学、微生物学和分子因素等交互作用相关，然而尚不清楚哪一种因素与创面愈合存在更密切的联系。早在20 世纪，Lunniss 等［41］分析了18 例瘘管切除标本中的内括约肌成分瘘管内衬，发现7 例标本为移行区上皮，5 例为复层鳞状上皮，1 例为混合鳞状和柱状上皮，其余5 例无上皮。尽管作者没有将上皮形成程度与临床结果相关联，但他们假设上皮形成可能与创面的愈合相关。而在Mitalas等［42］的研究中，对接受直肠推进皮瓣（rectal advance flap，RAF）修复的44 例远端瘘管标本进行分析，发现11 例上皮形成，并认为内衬上皮的存在不影响RAF 修复的结果。由此可见，创面组织的纤维化程度与愈合是否存在联系还需进一步证据阐明。

细菌在慢性创面中并不常见，也尚不清楚它对伤口愈合的影响。在Seow-Choen 等［43］的实验中，从18 例肛瘘病人（不包括炎症性肠病和急性化脓病人）的刮宫样本采集肉芽组织，发现最常见的类型为肠源性细菌：大肠杆菌（22%）、脆弱芽孢杆菌（20%）和肠球菌（16%）。基于上述结果，他们推测，肛瘘的慢性炎症不是由过多的微生物导致的。另一项研究［44］对克罗恩和特发性瘘管进行了活检，在32 份标本中，仅发现一份含有与管壁关联的细菌，由此作者得出结论，瘘管并不含有高水平的黏膜相关细菌。尽管如此，有研究证明，细菌中成分可能在慢性炎症中扮演重要角色。一项试点研究［45］中，10 个肛瘘里检测出9 个含有肽聚糖（细菌细胞壁成分），作者认为肽聚糖可能对炎症有影响，但由于样本量小，并不能确定临床结果与肽聚糖表达之间的关系。

近年来，肛瘘创面炎症和愈合更趋向于用炎症机制来解释。在Ratto等［46］的研究中，对瘘管组织间的细胞因子和微生物肽进行了比较，与正常肛周皮肤和黏膜相比，发现瘘管组织无论近端或远端均强烈表达IL-1β 和IL-8，并且还显示pERK 和NF-κB 两种信号通路的高表达，而上述细胞因子和信号通路都与炎症反应的调节相关。不但如此，Van onkelen等［47］在27 例接受保留括约肌修复术的病人中，分析了瘘管远端部分8种细胞因子的表达，发现4种促炎细胞因子在标本中表达：IL-1β（93%）、IL-8（70%）、IL-12p40（33%）和TNF-α（30%）。但是，他们无法将细胞因子表达的差异与手术结果联系起来。

4.2 干细胞衍生外泌体治疗复杂性肛瘘干细胞由于具备免疫调节、组织修复等优点，正逐渐成为部分疾病治疗的潜在方案。然而，干细胞治疗仍面临许多问题，如移植细胞的低存活率、异质性等。在创伤修复中，干细胞的功能与其旁分泌能力密切相关，而其旁分泌的方式主要以外泌体释放的途径来实现。最近有研究称，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）衍生的外泌体具有稳定性、低免疫原性等优点，而且和MSCs 有着相似的作用，同样具备修复组织、抑制炎症反应和调节免疫等功能［48］。目前，有文献报道应用脂肪干细胞（adipose stem cells，ASCs）治疗肛腺感染性肛瘘、克罗恩肛瘘和直肠阴道瘘等复杂性肛瘘均取得了良好的临床疗效［49］。ASCs可通过诱导促炎因子减少，并且使抗炎因子增加，缓解创面局部的炎症反应；同时还能以自分泌和旁分泌的途径分泌相关细胞因子，激活成纤维细胞，促进血管新生，肉芽组织形成，最终加速创面边缘上皮化［50］。研究表明，在这一系列创面愈合相关的过程中，ASCs来源的外泌体发挥了重要作用［51-55］。

4.3 miRNA 促进肛瘘创面愈合miRNA 作为一种调节各类生理病理过程的小分子RNA，已被大量研究证实在皮肤创面愈合中起到了显著作用，而寻找疾病特征性miRNA 及其作用靶点或者相关通路是揭示其生物学功能的关键步骤。蔡涛等［56］选择6例高位复杂性肛瘘病人并行手术治疗，将切除的瘘管组织标本和瘘管远端正常组织标本作配对对比，采用高通量测序技术筛选出瘘管组织中差异表达miRNA。其中，与远端正常组织的miRNA 表达水平相比，瘘管组织中hsa-miR-2355-3p 的表达水平是正常组织的7.07 倍，hsa-miR-3910 的表达水平是正常组织的3.01 倍；然而hsa-miR-1277-3p 在瘘管壁组织中的表达水平却只有正常组织的8%，hsa-miR-616-5p 的表达水平仅占正常组织的10%。同时，研究者通过TargetScan、miRanda 两个数据库对所有差异表达miRNA 进行了靶基因预测以及后续交叉靶基因的GO和KEGG富集分析，发掘出大批与创面愈合密切关联的信号通路，例如Ras、MAPK、PI3K-Akt、cAMP 等，以上通路的抑制可能是肛瘘术后创面难愈的原因。即便如此，目前有关肛瘘差异表达miRNA 的研究报道仍相当有限，以特征性miRNA 的靶标为切入点，调控信号通路和生物学过程依然有待后续实验证明。

4.4 肛瘘创面渗液来源外泌体miRNA的提取、鉴定

4.4.1创面渗液外泌体的提取与鉴定 选择符合低位单纯性肛瘘诊断标准病人60例，行低位单纯性肛瘘切除术后，随机均分为药膏组、康复新液组和凡士林组三组，分别采用药膏纱条、康复新液纱条和凡士林纱条术后创面换药，每日早晚各1 次。于术后第3、5、7、9 天，换药时收集创面外周敷料置入30 mL 的0.9%氯化钠溶液中，静置5 min，取浸出液过滤。在4 ℃下5 000g离心5 min，去除底层固体杂质，留取上清，用DMEM 以1∶10 体积比例稀释，0.22µm 孔径滤膜过滤除菌，置于-80 ℃保存备用。显微镜下观察炎症细胞分布并计数；ELISA 法检测创面渗液中炎性因子IL-4、IL-10、TGF-β、IL-1β、IL-6、TNF-α 的表达水平。采用QIAGEN 公司的exoEasy Maxi Kit 外泌体提取试剂盒提取渗液中的外泌体，透射电子显微镜观察外泌体的纯度和形态，纳米颗粒跟踪分析法检测外泌体的粒径和浓度，蛋白质印迹法鉴定外泌体相关蛋白标志物CD9 和CD63 的表达。

4.4.2miRNA 的提取与靶基因预测 分别提取各组外泌体总RNA，采用Exiqon miRCURY LNA Universal RT microRNA PCR 芯片（Exiqon 公司）检测各组创面渗液中外泌体的差异表达miRNA，筛选相关核心miRNA。采用Targetscan、Pictar、MiRanda 数据库预测差异miRNAs 的靶基因，筛选并确定目标miRNA-mRNA调控对以备功能验证。

4.5 创面渗液来源外泌体miRNA 加速肛瘘术后愈合近年来，外泌体源性miRNA 越来越频繁用于抑制炎症、促进创面愈合，其主要来源依旧是通过干细胞分离。据报道［57］称，与不愈合的慢性伤口相比，愈合慢性伤口渗液中含有更丰富的细胞外囊泡（extracellular vesicles，EV），并且在伤口愈合的炎性阶段，产生的EV 比正常皮肤高出6倍。基于上述结果，作者从愈合和非愈合病例分别提取了创面渗液，用来处理极化至M1 的人外周血单核细胞衍生的巨噬细胞（monocyte-derived macrophages，MDMs），发现来自愈合病例的伤口渗液引起了细胞聚集，这正是细胞转化的特征。因此，他们认为，EVs是创伤部位细胞间通信的主要促进因素。不仅如此，中医也有煨脓长肉促进创面愈合的特色疗法，其认为脓由气血所生，是机体正气载毒排出的过程，是有利于创面愈合的“脓”［58］。有研究表明，煨出之脓不但含有创面组织中的坏死成分，还包含大量有利于创面愈合的巨噬细胞、成纤维细胞等［59］。因此基于以上结果，我们可以大胆假设：创面渗液来源的外泌体miRNA 能够抑制肛瘘术后创面炎症并加速愈合。

5 结论和展望

目前外泌体源性miRNA 与创面炎症、愈合相关的研究正在快速发展。已有部分文献表明，外泌体携带的miRNA 在抑制肛瘘术后创面炎症、加速愈合上均拥有不错的前景和潜力。外泌体作为细胞间通信的小分子载体，携带各种生物信息物质，尤其是miRNA 在调控炎症反应和促进创面愈合中发挥了显著作用，其非侵入性、稳定性和靶向性等优点让它为众多疾病提供了新的诊断和治疗方式。

尽管如此，外泌体源性miRNA 治疗肛瘘术后创面炎症的研究仍需要深入。首先，外泌体虽然能从各种体液里提取，但其纯化和检测依旧面临一定挑战，并且由于不同细胞分泌的外泌体存在差异性，而目前仍然以干细胞来源外泌体miRNA 为主要研究对象，这很可能影响其未来应用的广泛性。因而，拓展更多途径的外泌体来源miRNA 以及探索其对不同疾病的作用机制至关重要。可以预见的是，随着外泌体miRNA 和分子靶向研究的不断深入，创面渗液来源外泌体miRNA 将成为抑制肛瘘术后创面炎症、促进愈合的新型治疗方案。