儿茶素干预硬脂酰辅酶A去饱和酶-1表达抗小鼠肝纤维化损伤

万 星，陶柏楠，邵文翠，金铮钰，黄德斌，袁 林

(湖北民族大学 1.医学部、2.风湿性疾病发生与干预湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000)

肝纤维化(liver fibrosis,LF)是肝脏中激活的肌成纤维细胞(主要是肝星状细胞)分泌细胞外基质蛋白产生纤维性瘢痕的病理过程。肝纤维化若不及时治疗会向肝硬化肝癌发展，最终引起死亡[1]。目前，针对肝纤维化的高效药特别少，因此需要开发新的高效和特异性的药物来预防或治疗肝纤维化，尤其是晚期肝纤维化，即所有慢性肝病的有害下游。肝纤维化发生机制和涉及的基因众多，但随着社会环境及生活方式改变，非酒精性脂肪肝诱导的肝纤维化人数大量增多，在对非酒精性脂肪肝机制进行研究时，发现脂质代谢中的脂肪酸作为新机制与肝纤维化关系密切，如：脂肪酸可影响肝星状细胞凋亡[2]，肝星状细胞活化释放基质需要巨大能量，为了满足这一需求，肝星状细胞发生代谢重编程，包括warburg效应、脂质代谢增加等[3-4]。因此，本研究着重探讨儿茶素(catechin,CA)对脂质代谢这一新机制的影响，CA最早在茶叶中被提取研究，后研究人员发现其存在多种中草药中，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、保护心血管等作用[5～7]。课题组在前期研究鬼箭羽醇提物抗肝纤维化功效时，发现CA抗纤维化的效能极高[8]，后通过基因芯片筛查差异性基因，硬脂酰辅酶A去饱和酶-1(stearoyl-CoA desaturase-1，SCD1)引起我们关注，SCD1是脂肪酸代谢限速酶，催化饱和脂肪酸变成单不饱和脂肪酸，影响脂质代谢[9-10]，加之文献报导CA可干扰脂质代谢抗酒精性脂肪肝[11]，因此，我们合理提出假说：CA可能通过影响SCD1表达干扰脂质生成抗肝纤维化，通过实验论证，为进一步讨论CA抗肝纤维化机制奠定基础并为LF治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 动物C57BL /6 小鼠，♂，体质量(18±2) g，SPF级，购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK(辽)2020-0001。

1.2 药物与试剂(+)-儿茶素(上海源叶生物，LOT：P20O7F23087)；CCl4(国药集团化学试剂有限公司，临用前溶于橄榄油)；AST/ALT试剂盒(南京建成，AST批号：20201219，ALT批号：20201221)；TG试剂盒(南京建成，批号：20210603)；鼠SCD1(英国Abcam，LOT:GR3297026-12)；内参GAPDH一抗和二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)；TRIzol、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA eraser(日本Takara，LOT:AJ60796A)、TB Greenpremix EX TaqTMⅡ(日本TaKaRa，LOT：AI62517A)；油红O套盒(Biossci,BP037)。

1.3 仪器显微镜(Nikon E200，日本)；酶标仪(Thermo Scientific Multiskan GO，美国)；蛋白电泳电转仪(Bio-Rad，美国)；冰冻切片机(Thermo，美国)；正置显微镜(Olympus CX-31，日本)。

1.4 方法

1.4.1药物配制 CA浓度400、200、100 mg·kg-1。称取500 mg CA加生理盐水31.25 mL配成高剂量16 g·L-1，称取500 mg CA加生理盐水62.5 mL配成中剂量8 g·L-1，在配好的中剂量中取15 mL加生理盐水稀释至30 mL配成低剂量4 g·L-1，水飞蓟宾给药剂量200 mg·kg-1，按上述方法配成8 g·L-1。每管溶液约为8只小鼠1周的使用量。

1.4.2实验分组与模型 小鼠适应性喂养后，随机分为6组：对照组(normal group,NG)、CCl4组、100 mg·kg-1CA组(CA-L)、200 mg·kg-1CA组(CA-M)、400 mg·kg-1CA组(CA-H)、200 mg·kg-1水飞蓟宾组(Sil)。模型组小鼠腹腔注射含 25% CCl4的橄榄油溶液 1.6 mL·kg-1，每周 2 次，共6周。药物组在造模同时，前3周给小鼠灌胃CA和水飞蓟宾，每次灌0.5 mL，正常组灌胃等体积生理盐水。所有小鼠6周后禁食不禁水，24 h后处死，按要求做后续操作。

1.4.3肝脏外观和肝指数测定 称质量，小鼠眼球采血，颈椎脱臼处死，取出肝脏，用高倍相机在同背景同视野下拍大体形态。肝指数/%=肝脏质量(g) /体质量(g)×100%。

1.4.4血清学指标 ALT、AST、TG按照南京建成试剂盒说明书操作。

1.4.5HE染色、Masson染色、α-SMA和Collagen Ⅰ免疫组织化学 参照本课题组已发表文章[8]。

1.4.6油红O染色 10%甲醛固定标本，冰冻切片，厚约6～10 μm,蒸馏水稍洗；将固定好的切片入60%异丙醇中漂洗30 s，取油红O储备液6 mL，加蒸馏水4 mL，混合后静置10 min，即可用来染色，染色时间8 min，60%异丙醇稍洗去多余染液，蒸馏水洗；用滤纸将切片周围水分抹干，专用封片剂进行封片。

1.4.7QPCR检测SCD1的表达 约称取30 mg小鼠肝脏，加1 mL TRIzol研磨，静置5 min，4 ℃，12 000 r·min-1，离心8 min，取800 μL上清，加160 μL氯仿，混匀，静置5 min，4 ℃，12 000 r·min-1,离心10 min，取400 μL上清转移至无RNA酶的EP管，加等体积异丙醇，混匀，静置10 min，4 ℃，12 000 r·min-1,离心15 min，倒掉上清，扣干，加1 mL 75%乙醇洗涤沉淀，4 ℃，12 000 r·min-1,离心10 min，倒掉上清，扣干，风干。按照试剂盒说明书逆转录1 000 ng RNA，再进行40循环的PCR，SCD1引物：F:5′-TTCGTTGCCACTTTCTTGCG-3′，R:5′-AAGTTGATGTGCCAGCGGTA-3′，GAPDH引物：F:5′-TGAACGGGAAGCTCACTGG-3′,R:5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。以2-ΔΔCt计算表达。

1.4.8Western blot检测SCD1的表达 参照本课题组已发表文章[8]，SCD1一抗浓度1 ∶1 000，二抗浓度1 ∶10 000。

1.4.9分子对接技术检测CA与SCD1的互作 用Schrodinger先画出2D结构的CA，再转变成3D结构的CA，用CHARMm力场对受体结构进行优化；靶点蛋白的晶体结构利用Discovery Studio中的BLAST Search(DS Server)模块获得，然后使用cdocker方法执行分子对接，并使用Discovery Studio的智能最小化器最小化算法进行最小化，在计算结束时保存每个配体的十个得分最高的构象，最后，对CA化合物与SCD1的结合物进行自由能计算。

2 结果

2.1 CA对肝纤维化小鼠肝指数的影响肝纤维化会损伤肝脏。肝肿胀是肝损指标之一，肝指数可部分反应肝脏肿胀程度。CCl4组肝指数高于正常组(P<0.01)，不同浓度CA量效依赖地降低CCl4引起地肝指数升高(P<0.01)，水飞蓟宾也降低了CCl4引起地肝指数升高(P<0.01)，同剂量CA和水飞蓟宾的作用无差异，见Fig 1。

2.2 CA对对肝纤维化小鼠肝脏形态的影响肝脏受损还可通过颜色、表面光滑度、组织结构来观察。HE染色可以观察炎症水肿、组织结构异常。正常组小鼠肝脏表面光滑，无褶皱，呈红褐色，肝小叶结构正常，CCl4组小鼠肝脏表面出现凹陷褶皱，泛白，出现明显水肿，有炎症浸润，肝小叶被破坏，假小叶生成，CA组呈浓度梯度地减少泛白水肿和炎性浸润，Sil组也减少水肿、炎症，减少肝损，相同剂量CA和Sil作用无差别，见Fig 2。

2.3 CA对肝纤维化小鼠血清学指标的影响ALT、AST是肝损金指标。肝纤维化越严重对肝脏损害越大。CCl4组较正常组ALT、AST明显升高(P<0.01)，CA可量效依赖地降低其表达(P<0.01)，Sil也可降低其表达(P<0.01)，同剂量CA降低数值大于Sil，但差异无统计学意义(P>0.05)，见Fig 3。

Fig 1 Effect of different doses of CA and **P<0.01 vs NG;#P<0.05 vs CCl4,##P<0.01 vs CCl4

Fig 2 Effect of different doses of CA and Sil on liver morphology and HE staining A:liver morphology,B：HE staining

2.4 CA对肝纤维化小鼠α-SMA和细胞外基质胶原的影响肝星状细胞的激活是肝纤维化的关键，α-SMA是星状细胞激活的标志，CollagenⅠ是肝星状细胞激活后释放的主要的细胞外基质。利用免疫组织化学技术检测α-SMA和CollagenⅠ的表达，可反映肝纤维化的程度。CCl4组α-SMA和CollagenⅠ明显升高(P<0.01)，CA可量效依赖地降低二者的表达，Sil也可以减少其表达(P<0.01)。为了证明细胞外基质胶原的变化，同时使用了Masson染色观察胶原堆积，正常组无胶原生成，CCl4组大量胶原生成，CA组呈浓度梯度地减少胶原生成，Sil组也减少胶原的生成，相同剂量CA和Sil作用无差别，见Fig 4。

Fig 3 Effect of different doses of CA and Sil on ALT and AST **P<0.01 vs NG;##P<0.01 vs CCl4

2.5 CA对肝纤维化小鼠脂质的影响为检测肝纤维化时脂质变化，我们采用油红O染色检测脂质堆积情况，试剂盒检测甘油三酯生成。CCl4组较正常组脂质明显增多，CA量效依赖地降低脂质合成，Sil也降低脂质合成；为了进一步量化脂质含量，检测了血清中TG含量，CCl4组较正常组TG明显增多(P<0.01)，CA量效依赖地降低TG合成，Sil也降低TG合成(P<0.01)，同剂量CA降低地数值更多，但差异无统计学意义，见Fig 5、Fig 6。

2.6 CA对肝纤维化小鼠SCD1的影响CCl4组中小鼠肝脏脂质发生变化，而SCD1是脂质代谢的限速酶，于是利用QPCR和Western blot实验分别检测SCD1mRNA和蛋白的变化，发现CCl4组中SCD1在mRNA和蛋白水平均明显升高(P<0.01)，CA量效依赖地降低其表达，Sil也降低其表达(P<0.01)，同剂量CA和Sil对SCD1的结果差异无统计学意义，见Fig 7。

2.7 CA与SCD1的作用方式为了弄清CA是否能靶向作用SCD1蛋白，在上述结果的基础上，利用分子对接技术，初步检测CA与SCD1是否存在直接作用并为后续实验奠定基础。结果发现CA与SCD1的结合亲和力较高(-5.4 kcal·mol-1)，观察到SCD1有4个氢键(Arg74,Asn148,Trp184和Val187)，还有6个氨基酸通过范德华力和CA相互作用，CA-SCD1的复合物通过在CA与SCD1氨基酸残基之间形成非共价相互作用而稳定，见Fig 8。

Fig 4 Effect of different doses of CA and Sil on expression of α-SMA,collagen I by IHC and Masson staining

Fig 5 Effect of different doses of CA and Sil on lipid in oil red O staining

Fig 6 Effect of different doses of CA and Sil on TG n=8)**P<0.01 vs NG;##P<0.01 vs CCl4

3 讨论

肝纤维化治疗方法主要包括病因治疗、抗纤维化药物、原位肝移植、细胞疗法及中医治疗等[12]。课题组在前期研究鬼箭羽醇提物时发现CA具有良好抗纤维化能力，可激活TGFβ-Smad信号通路，为了进一步探讨其机制，做了正常组、模型组和药物组基因芯片筛查，筛出系列基因。在研究非酒精性脂肪肝机制时，发现脂质中的脂肪酸对非酒精性脂肪肝引起的肝纤维化意义重大，而芯片结果中SCD1基因恰好是脂肪酸代谢限速酶，可影响脂肪酸含量影响脂质代谢，因此，我们提出假说：CA是否能作用SCD1干扰脂质生成抗肝纤维化？为了验证假说，本研究完成以下内容：

Fig 7 Effect of different doses of CA and Sil on expression of n=8)A:SCD1 mRNA,B:SCD1 protein bands,C:SCD1 protein statistical chart.**P<0.01 vs NG;##P<0.01 vs CCl4

Fig 8 Binding site and mode of CA to SCD1

首先，验证CA抗肝纤维化作用。肝纤维化导致肝脏损伤，所以同时检测了肝损指标：肝指数、ALT、AST和肝纤维化标志：α-SMA和Collagen Ⅰ，结果提示CCl4可增高上述指标的表达，诱发肝纤维化，CA可量效依赖地降低其表达，减轻肝纤维化的发生，同时，HE染色进一步说明CCl4导致肝脏损伤，CA减轻损伤，Masson染色显示，CA可减轻胶原堆积，结论一致。

其次，验证肝纤维化时脂质改变及药物作用。油红O染色可检测脂质生成，结果提示CCl4组脂质明显增多，CA可量效依赖地减少脂质生成，TG是脂质重要组成成分，CCl4组TG明显增多，CA可量效依赖地减少TG生成，两项指标初步证实脂质参与肝纤维化的发生，CA可干扰脂质生成。

SCD1是一种内质网酶，是脂肪酸从头合成途径中最终步骤的限速酶[16,10]，脂肪酸合成是脂质代谢的重要环节，结果显示，CCl4增加SCD1mRNA和蛋白的表达，CA量效依赖地降低其表达，表明CA可影响SCD1的表达。CA和SCD1的作用关系和模式：CA与SCD1的结合能为- 5.4 kcal·mol-1，小于0，表明亲和力较强，CA可通过氢键和范德华力与SCD1直接作用。

另，文中使用阳性对照水飞蓟宾，发现在同等中剂量下，CA抗纤维化能力统计学无差异，表明中剂量CA与水飞蓟宾抗纤维化能力相同。综上，CA可影响SCD1并通过模拟表明两者有直接作用，但CA是否通过靶向SCD1发挥作用需进一步实验，同时CA减少脂质生成，是通过SCD1干扰脂肪酸从头合成途径还是其它路径，也需进一步研究。